真核生物的5S rRNA基因與其它三種rRNA基因不在同一條染色體上,它是由核仁以外的染色體基因轉錄的,然後運輸到核仁內參與核糖體的裝配。5S rRNA基因的數量比45S rRNA轉錄單位多,人的5S rRNA基因有500個拷貝,並且在染色體上串連排列。非洲爪蟾的5S rRNA基因的一個重複單位含有一個5S rRNA基因、一個不轉錄的假基因(101bp的5S rRNA基因的片段),每個重複單位間被不轉錄的間隔序列隔開,間隔序列的長度變化不定,最長達400bp;5S rRNA基因轉錄的速度很快,其結果產生過量的5S rRNA,有些最後要被降解掉。
5S rRNA基因是由RNA聚合酶Ⅲ轉錄的,原初轉錄物的5’端與成熟的5S rRNA的5’端完全相同。在某些生物中,3’端通常含有多餘的核苷酸,在加工時要被切除。所以,5S rRNA只需要進行簡單的加工,或者根本不需要進行加工。