預防用疫苗臨床前研究技術指導原則
由病毒、細菌或其他病原微生物為起始材料，經培養增殖製成的減毒、滅活的病原體，或再經純化、裂解、亞單位（包括細菌類毒素）等方法處理製備的富含免疫原性，刺激機體產生特異性免疫學反應而達到預防某種疾病的產品，為預防用疫苗。
本指導原則適用於用病毒、細菌或其他病原微生物製備的預防用疫苗，其目的是為該類製劑提供一個共同的原則，指導制定臨床前研究的方案，和確定具體的研究內容。
內容簡介
一、基本原則
二、用於疫苗研究用的菌毒種
三、疫苗的生產工藝研究
四、藥理、毒理和生物分布
五、質量控制及檢定的要求
六、臨床研究用樣品要求
一、基本原則
（一）應符合國家《藥品管理法》等相關法律法規的要求；
（二）對所預防的疾病的流行情況進行研究,包括疾病的危害程度 所涉及的人群及病原的型和亞型等；
（三）對研製該類製品用於預防疾病的有效性、安全性及必要性進行分析；
（四）應對該製品用於預防該疾病的利益風險比進行研究。根據該製品的預防方案可能達到的效果及可能出現的副作用或危害，對總體的利弊權衡進行評價，並提出擬採取避免或減少其危害性或副作用的措施。這種評價將是該方案能否獲得批准的重要依據之一。
二、用於疫苗研究用的菌毒種
研究疫苗所用的菌毒種必須證明為引起本病的細菌、病毒或其他病原體，如該菌毒株分離自人體，下述內容必須清楚。
（一）菌毒株名稱及來源：
1．菌毒株名稱
2．菌毒株來源
（1）分離菌毒株的宿主一般情況；
（2）發病地點、發病日期；臨床確診日期、實驗室確診日期；病人病程及病人轉歸。
3．菌毒株分離原樣本： 咽試子、漱口液、痰液、血液、糞便、尿液、屍解標本的組織名稱；取樣日期；取樣時病人的病期。
4．鑒於人類的血液在同一時間內較少感染多種病毒或細菌，而咽試子、漱口液、痰液、尿液、糞便等樣品難免污染其他外源因子，因此用病人血液分離的菌、毒株較適宜用於研究疫苗。
5．分離菌、毒株的其他自然樣本名稱、來源、數量、取樣方法等。
（二）菌、毒株分離過程
1．用細胞分離病毒，所用細胞名稱、代次、來源應清楚，應進行細胞無菌檢測、支原體和外原因子等檢測；病毒分離不宜使用腫瘤原性的細胞系。儘可能使用非腫瘤原性細胞，如人二倍體細胞或Vero細胞等。
2．用動物分離病毒，對所用動物名稱、品系、級別、年齡、接種途徑、飼養條件和製備毒種的動物臟器名稱等須詳細記載；如再適應到細胞，則還應參照上述對分離用細胞的要求。
3．確定分離菌株所用培養基名稱、種類，以及分離培養的溫度和條件。
（三）菌、毒株分離傳代特性
應包括樣品處理方法、首次盲傳確證菌毒株陽性代次、菌毒株確證檢定方法、每代培養天數、病毒滴度、滴定方法、動物是否發病或死亡等資料。
（四）菌毒種建立和保存
應包括原始菌毒種代次、滴度，添加的保護劑的名稱和濃度、存儲條件等資料；原代菌毒種是指已適應到可生產疫苗的細胞或培養基，可穩定傳代、保留抗原性、並經過檢定可用於疫苗生產的菌毒種。種子批的建立應符合現行版《中國藥典》“生物製品製品檢定用菌毒種管理規程”的要求，應對種子批進行菌毒種的傳代和限定代次的研究，以證明主種子和工作種子批在規定代次內的生物學特性與原始菌毒種的一致性。
（五）菌毒種的檢定
1．鑑別試驗：可採用血清學、生物學、核酸序列分析等方法證明為該菌毒種。明確該病原體及其它相關生物分子的基因序列及結構，並與我國主要流行株的核苷酸和胺基酸同源性進行分析以及明確其血清型、亞型和/或基因型，對該種基因型或血清型的流行情況進行分析，若存在不同的血清型或基因型，應對所選擇的血清型或基因型與其它血清型或基因型交叉反應或交叉保護性進行分析和研究。
2．無菌檢查：按照現行版《中國藥典》的要求進行，應符合規定。
3．外源因子檢查：按照現行版《中國藥典》的相關要求進行，應符合規定，取樣量應足夠檢測試驗的需要。
4．擴增能力和感染性滴度：應能達到按生產工藝要求順利生產合格疫苗的要求。應建立測定菌毒種擴增能力和感染性滴度的方法和標準，並提供這些擴增能力和感染性滴度與疫苗有效性之間的相關性數據。
5．免疫原性檢查：菌毒種的免疫原性是衡量該疫苗是否有效的重要指標，應制定和建立測定菌毒種免疫原性的有效方法和標準，以評估該候選菌毒種能否進行疫苗生產。
6．減毒特性
（1）如研製減毒活疫苗應對原始菌毒株的生物學、血清型、基因型和免疫原性進行研究；減毒方法、減毒過程、減毒程度和減毒後的生物學、血清型、基因型和免疫原性，並進行減毒前後的特性對比，尤其要對減毒後的安全性和免疫原性作出確切的結論；
（2）應建立減毒特性指標的驗證方法、動物模型和減毒後安全性的標準以及檢測和警戒毒力回復的依據等；
（3）對製備注射劑的減毒活疫苗，除一般的外源因子檢測外，還應驗證無逆轉錄病毒的污染。該驗證方法可採用PERT法；
（4）如已知該病毒具有嗜神經毒性，其驗證要求可參考《IABS Scientific workshop on neurovirulence test for live virus vaccines, WHO,31 January 2005》。
三、疫苗的生產工藝研究
（一）建立菌毒種庫
應建立三級種子庫。對種子庫的遺傳穩定性進行分析，明確該種子庫可以傳代的次數。生產用菌毒種、細胞和涉及生產的工藝技術應注意專利，應進行相關專利查詢。
（二）生產用細胞和/或培養基
1．生產用細胞應符合現行版《中國藥典》中“生物製品生產用動物細胞基質製備及檢定規程”的要求，如用傳代細胞系應建立三級細胞庫；
2．生產用培養基儘可能避免使用動物來源和可能引起人體不良反應的原材料，禁止使用來自瘋牛病疫區的牛源性原材料。
（三）疫苗原液生產工藝的研究
1．生產工藝的主要技術參數的確定
（1）病毒與細胞的接種比例、MOI的最佳參數、細胞培養和病毒培養的最佳溫度、培養時間和收穫時間。菌毒種的接種量，培養和發酵條件等技術參數的研究確定；
（2）滅活劑的選擇和依據；
（3）滅活或裂解條件及滅活或脫毒效果的驗證，滅活效果驗證的依據、方法；滅活效果的驗證，應採用儘可能敏感的細胞或培養基和方法進行；
（4）原液的濃縮和/或活性抗原的提取純化等工藝研究：純化和提取工藝中各種條件進行最佳化，純化和提取工藝對抗原活性成分是否影響，應建立穩定的純化工藝，包括純化時的回收率、抗原活性和純度等的穩定性；並制定相應的質控指標和檢測方法，按GMP要求在符合GMP要求的生產環境下生產；
（5）初步確定起始投料、原液、半成品和成品的產出比的理論數據。
2．疫苗對佐劑的要求
目前能用於疫苗的佐劑多為氫氧化鋁，而鋁佐劑通常使疫苗產生的抗體滯後，且增加注射局部的副反應機率。如疫苗的抗原能滿足免疫的需要，則不加佐劑為宜。如果在終製品中使用佐劑，則對以下問題應進行研究，對於已經明確有佐劑效應或者已經商品化的佐劑，只需提供該類製劑的組分或化學組成，國內外使用該類製劑的情況，無需再進行毒理和安全性研究。若國內外均未使用過該類佐劑,則必須對其作用原理、安全性及佐劑效應進行詳細的研究並建立切實可行的評價方法。
（四）疫苗的配方研究
應對疫苗的配方進行研究，如疫苗中添加的穩定劑成分，緩衝液、佐劑、以及凍乾疫苗的賦形劑成分等是否對疫苗造成影響。
四、藥理、毒理和生物分布
疫苗不同於一般的化學藥品，藥理、毒理的實驗要求具有特殊性，因此，該製品的藥理學試驗主要包括發生作用的原理、生物效價與劑量的關係、免疫程式和接種途徑與效果的關係等；在毒理學方面主要考慮接種部位和全身的病理反應、以及機體對該疫苗的非期望的免疫應答反應和這種反應的持續時間。由於以上各方面是互相關聯的，因此，應綜合考慮藥理、毒理和免疫原性或生物效價的因素。
應建立適當的試驗及檢測方法來評價疫苗的免疫原性或生物效價，如果有動物模型或可建立動物模型的，可以採用動物模型直接評價疫苗的生物效價，如：對一些有動物模型的感染性疾病，可以採用病原體的攻擊實驗來評價該疫苗的保護效果。而且要建立劑量與生物效價的關係，通過實驗最佳化免疫程式和接種途徑。若無法建立動物模型，應建立能驗證該疫苗有效性的體外實驗進行評價。
滅活疫苗的生物分布較難檢測和評價。減毒活疫苗的生物分布應建立敏感的動物模型，可測定接種疫苗後的病毒血症（或菌血症）以及持續時間，排毒（菌）方式和途徑，對是否呈現體內複製及感染的器官組織細胞應進行詳細的研究。
五、質量控制及檢定的要求
（一）生產過程中質量監控標準的建立及要求
在生產工藝的各個環節和步驟中的產品均應建立相應的監控標準，以便後續工藝的進行,保證產品的質量、工藝的穩定性。
（二）產品的質量檢定與要求
1．外觀檢查：根據樣品的特徵建立外觀的質量標準。
2．pH值檢測：可根據一般生物製品的要求建立標準，一般為7.2±0.5。
3．純度：主要用於評價純化製品中含有有效成分的量和雜質的最低限量，制定相應標準，通常可測定有效抗原在疫苗中的絕對值或測定主要雜質的量推算有效抗原在疫苗中的相對值。
4．宿主細胞 DNA和蛋白殘留量檢測：採用傳代細胞生產疫苗，應限制疫苗中的宿主細胞DNA和蛋白殘留量，進行方法研究時應建立相應的標準品，並對檢測試劑的敏感性和特異性進行驗證。疫苗中殘余宿主細胞DNA及蛋白殘留量可參考現行版《中國藥典》的相關要求。
5.無菌檢查：應符合現行版《中國藥典》的相關要求。
6．熱原或細菌內毒素檢查：可參照現行版《中國藥典》的相關要求進行； 也可以用其它方法檢測疫苗中的熱原物質。
7．抗生素檢測：預防用疫苗在生產過程中不得添加青黴素或其他β內醯氨類抗生素；如在生產過程中添加除上述以外的其他抗生素，應建立相應的檢測方法並規定抗生素殘留量的要求。
8．滅活效果的驗證：由於製備疫苗的病原體一般均對人類致病，因此應建立有效的滅活方法對該製品中的病原體進行滅活，並應對滅活效果進行驗證；在成品檢定中應建立滅活劑殘留量檢測的方法和限度標準。
9．異常毒性檢查：應符合現行版《中國藥典》的相關要求。
10．穩定性試驗：是指疫苗在常規保存溫度下的穩定性試驗。由於穩定性試驗的結果直接與製品的效期有關，且試驗觀察時間較長，因此應在生產工藝確定後儘早留樣進行，定期取樣測定製品效力和其他相關的質量指標；對穩定性試驗結果與加速穩定性試驗數據進行分析對比，可為正式產品的有效期確定提供依據。
11．效力試驗（生物效價）：由於用於預防的疫苗是通過機體的免疫應答反應發生作用的，因此應評價其體液免疫和細胞免疫的生物效價。在評價體液免疫效價時，應選擇實驗動物的品系，建立檢測動物血清抗體的診斷試劑，並對該類試劑進行驗證，可以計算小鼠ED50以及抗體產生的滴度，如有必要和可行，還應當建立評價抗體質量的方法，對抗體的性質進行評價，如亞型測定及抗原中和位點分析等；在評價細胞免疫效價時，應當建立檢測評價細胞免疫的方法（如特異性CTL反應的方法或Elispot方法等），也可通過對細胞因子的定量檢測評價其細胞免疫情況，如屬於常規檢定項目，該類方法應穩定、重複性好、可操作性強，並制定相應的質量標準。若有動物模型，可進行動物保護性實驗。
12．佐劑的質量評價：如最終製品含有佐劑，則應建立佐劑含量以及與之結合率的檢測方法，並制定相應質量標準。
13．疫苗標準品或參考品的研究：對於一種新疫苗而言，建立檢測疫苗的效力、免疫原性或毒性用標準品或參考品對判斷驗室研究階段與批量投產後的疫苗質量是否一致以及臨床試驗的評價是非常重要的。
六、臨床研究用樣品要求
（一）申請臨床試驗用的疫苗，按照國家GMP的要求,在符合現行中國藥品GMP的生產條件下生產的。
（二）臨床試驗用疫苗樣品應儘量使用與臨床前研究相同批的疫苗,其批量一般不少於1000人份，並能滿足臨床試驗對疫苗量的要求。
（三）進行臨床試驗的疫苗必須由中國藥品生物製品檢定所進行質量覆核。
