降解組測序

miRNA miRNA miRNA

背景及定義

隨著下一代測序或稱為高通量測序 (High throughtput sequencing) 技術發展，可找出數以千萬條 miRNA 之信息。 加上植 物 miRNA 通 常 與mRNA 進行完全或接近完全的配對引起標靶基因的剪下從而調控基因的表達，出現了一種新的實驗方法稱為降解組測序 (Degradome Sequencing)，它結合了高通量測序技術與生物信息學分析各自的優勢，已成功套用於阿拉伯芥，水稻等植物的miRNA 標靶基因篩選。
降解組測序：Degradome sequencing，主要針對miRNA介導的剪下降解片段進行測序，從實驗中篩選miRNA作用的靶基因，並結合生物信息學分析優勢，確定降解片段與miRNA精確的配對信息。

原理

降解組測序的原理是，在植物體內絕大多數的miRNA是利用剪下作用調控靶

實驗流程

基因的表達，且剪下常發生在miRNA與mRNA互補區域的第十位核苷酸上。靶基因經剪下產生二個片段，5’ 剪下片段和3’ 剪下片段。其中3’ 剪下片段，包含有自由的5’ 單磷酸和3’ polyA尾巴，可被RNA連線酶，連線產物可用於下游高通量測序；而含有5’ 帽子結構的完整基因，含有帽子結構的5’ 剪下片段或是其他缺少5’ 單磷酸基團的RNA是無法被RNA酶連線，因而無法進入下游的測序實驗；對測序數據進行深入地比對分析，可以直觀地發現在mRNA序列的某個位點會出現一個波峰，而該處正是候選的miRNA剪下位點（完整實驗流程參見右圖）。利用降解組測序，科研人員擺脫了生物信息學預測的限制，真正從實驗中找到了miRNA的作用靶基因。

技術優勢

♦ 高通量：一次測序得到1000萬條以上的序列
♦ 準確性高：從幾個到數十萬個拷貝的精確計數
♦ 高解析度：可以檢測單鹼基差異
♦ 重複性好：深度測序保證了檢測隨機性，不需要技術重複

信息分析流程

具體的生物信息分析如下：
1. 降解片段在選定的基因組上的分布
2. 鑑定樣品中的rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、polyN等非編碼RNA
3. 鑑定樣品中表達的靶mRNA
4. 統計mRNA的降解位點信息
5. 從mirbase指定範圍，尋找與降解的mRNA相關的miRNA，並作出示意圖

套用領域

降解組測序的套用，主要在確認上游 miRNA 的剪下基因，進而得知下游影響基因路徑。可由miRNA 微數組晶片或利用下一代測序發掘新的miRNA，來獲得 miRNA 表現量差異，從降解組測序確認 miRNA 剪下哪些基因，再由下游使用全基因晶片進一步檢測影響基因表現量差異，結合生物信息 Gene ontology (GO)、Pathway 分析與外表性狀，將植物 miRNA 的調控，由上而下整體性了解分析，降解組測序適時的扮演目前在 miRNA 研究中對於確認剪下基因的關鍵性角色。
降解組測序可廣泛套用於靶基因功能的研究、生物性狀的調控研究、致病機理研究及藥物的開發等多領域。