以下是重疊延伸PCR的原理及兩基因的引物設計：
A基因：
上游（F1）與開放閱讀框起始密碼子附近的序列相對應，並在5 ’末端添加酶切位點和3個保護鹼基；下游（R1）與B基因終止密碼子附近的序列及A基因5’末端起始密碼子附近的序列互補，並去除A基因的終止密碼子TAA
B基因：
上游（F2）與A基因終止密碼子附近的序列及B基因5 ’端起始密碼子附近的序列相對應，同樣去除A基因終止密碼子TAA；下游（R2）與B基因的開放閱讀框終止密碼子序列互補，並在5’末端添加酶切位點和2個保護鹼基。
先分別用F1、R1，F2、R2擴增出A和B基因，然後再用F1和R2將兩基因連線起來，得到融合基因。
外定點突變技術是研究蛋白質結構和功能之間的複雜關係的有力工具，也是我們在實驗室中改造/最佳化基因常用的手段。而採用重疊引物PCR介導的定點突變實驗是一種快速有效的在基因中特定位點引入特定突變的有效技術。該技術採用具有互補末端的引物，使PCR產物形成了重疊鏈, 從而在隨後的擴增反應中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來。此技術利用PCR技術能夠在體外進行有效的基因重組，而且不需要內切酶消化和連線酶處理，可利用這一技術很快獲得其它依靠限制性內切酶消化的方法難以得到的產物。該技術主要包括以下幾步：設計引物，PCR擴增基因兩端，回收兩端片段，兩端片段退火延伸，擴增全長基因。
1. 引物設計
重疊延伸PCR技術成功的關鍵是重疊互補引物的設計。可以有三種方法來設計引物，具體如下圖所示。
引物F及R為基因兩端特異引物，其中Fm及Rm為中間引物。其中引物Fm及Rm中間共享一段序列（至少10bp完全匹配，否則後續實驗很難成功），突變點可以設計在Fm或Rm，也可以兩條引物上都有突變點。突變點最好是位於引物的5’端，儘量避免出現在3’端。[w1]
2. 分別用引物F和Rm及Fm和R進行配對進行PCR。注意該步一定要用PFU酶，不要用Taq酶，因為Taq酶容易在PCR產物末端加A，從而可能會使產物移碼突變。
3. 分別回收第2步所得兩條PCR產物（一定要用膠回收，準確回收兩條目的條帶）。
4. 將第3步所得兩份PCR產物進行混合使其互為模板及引物，加入dNTP及Pfu或Taq酶進行PCR。進行PCR約5-10輪即可。
5. 取第4步PCR產物做為模板，加入引物F及R進行PCR擴增出具有突變的全基因。
