蛋白質分析技術

用於分析蛋白質的含量、純度、分子量、胺基酸組成和結構等的技術。 含量分析,胺基酸是含氮的化合物,一般蛋白質約含15%的氮,用克氏定氮法能計算出樣品中的蛋白質含量。用雙縮脲法測肽鏈的量用紫外分光光度計測在280nm波長的吸收值,即蛋白質中芳香族胺基酸的值用Folin酚試劑測蛋白質中酪氨酸的值以及用TNB S(三硝基苯磺酸)測定蛋白質中的賴氨酸的值等方法都能算出蛋白質的含量。簡單蛋白質只含胺基酸,容易測定。複合蛋白質還另含輔基,如糖、脂質、核酸和金屬等化學物質,還需用其他分析方法鑑定。

簡介

用於分析蛋白質的含量、純度、分子量、胺基酸組成和結構等的技術。

含量分析

胺基酸是含氮的化合物,一般蛋白質約含15%的氮,用克氏定氮法能計算出樣品中的蛋白質含量。用雙縮脲法測肽鏈的量用紫外分光光度計測在280nm波長的吸收值,即蛋白質中芳香族胺基酸的值用Folin酚試劑測蛋白質中酪氨酸的值以及用TNB S(三硝基苯磺酸)測定蛋白質中的賴氨酸的值等方法都能算出蛋白質的含量。簡單蛋白質只含胺基酸,容易測定。複合蛋白質還另含輔基,如糖、脂質、核酸和金屬等化學物質,還需用其他分析方法鑑定。

純度鑑定

從樣品中純化蛋白質,其純度鑑定方法有聚丙烯醯胺凝膠電泳、電聚焦電泳和末端分析等。若兩種電泳圖譜都呈現一條區帶或恆定的末端胺基酸,就可認為此蛋白質已經純化。

分子量測定

一般把分子量大於10 000的稱為蛋白質,小於10 000的稱作多肽。最大的蛋白質的分子量可上百萬。測定的方法如凝膠過濾、S D S-聚丙烯醯胺凝膠電泳和超離心等,後者用於測定分子量較大的蛋白質,需使用精密而昂貴的儀器。

胺基酸組成分析

經過酸、鹼或酶處理把蛋白質的肽鏈拆開,即水解成游離胺基酸。用紙層析、薄層層析法等可定性鑑定組成蛋白質的20種胺基酸。用離子交換層析法可以精確測定出各種胺基酸的含量。用離子交換層析法原理設計製造的胺基酸自動分析儀,能精確、快速定量測定蛋白質的胺基酸組成,是目前廣泛套用的方法。

結構分析

各種蛋白質均具有其自身特定的胺基酸序列的多肽鏈,即一級結構。多肽鏈又以特定的捲曲摺疊方式形成空間結構,即二級、三級和四級結構。測定一級結構的主要方法:是根據艾德受(Edman)發明的化學反應,用試劑異硫氰酸苯酯從鏈的N(-NH2)端逐個降解成胺基酸的衍生物,鑑定每步反應的產物,可得出肽鏈的胺基酸序列。根據這個原理設計的蛋白質序列儀,用毫克或微克的樣品一次可自動測定40~50個序列。如果要得到完整的一級結構,尚需把蛋白質裂解成肽的碎片,經過肽的分離純化,肽的序列測急然後連成完整的序列。儘管有精密的自動化儀器,一級結構分析仍是複雜、量大、費時的工作。近年來廣泛使用測定DNA的序列再推導出胺基酸序列的方法使序列分析又大大簡化了。空間結構測定包括使用晶體X-衍射分析、CD光譜、核磁共振譜(NMR)和雷射拉曼光譜分析等方法,要求更為複雜的技術和山貴的儀器。

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