實驗材料介紹
1）載體質粒和轉化受體菌株：
實驗所使用的載體質粒DNA為pBS,轉化受體菌為E. coli DH5α菌株。
E. coli DH5α菌株帶有β-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。
載體質粒DNA pBS上帶有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調控序列和β-半乳糖苷酶N端146個胺基酸的編碼序列。(這個編碼區中插入了一個多克隆位點,但並沒有破壞lacZ的閱讀框架,不影響其正常功能。)
在各自獨立的情況下,pBS和DH5α編碼的β-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在pBS和DH5α融為一體時可形成具有酶活性的蛋白質。
這種LacZ基因上缺失近操縱基因區段的突變體與帶有完整的近操縱基因區段的β-半乳糖苷酸陰性突變體之間實現互補的現象叫α-互補。
2）實驗用顯色方法
實驗中使用X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)而非直接使用β-半乳糖。
X-gal 以及 β-半乳糖 均為 β-半乳糖苷酶底物，但是X-gal不能誘導β-半乳糖苷酶操縱子。
實驗中使用IPTG以誘導β-半乳糖苷酶操縱子。
X-gal在β-半乳糖苷酶作用下生成深藍色產物。
實驗原理
1）初步篩選
載體質粒DNA pBS上帶有Ampr 基因而外源片段上不帶該基因,故轉化受體菌後只有帶有pBS DNA的轉化子才能在含有Amp的LB平板上存活下來;而只帶有自身環化的外源片段的轉化子則不能存活。此為初步的抗性篩選。
2）藍白篩選
當外源片段插入到pBS質粒的多克隆位點上後會導致讀碼框架改變, 表達蛋白失活, 產生的胺基酸片段失去α-互補能力, 含重組質粒的轉化子在生色誘導培養基上只能形成白色菌落。
而
沒有重組質粒的轉化子產生α-互補，在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導形成藍色菌落。
實驗干擾
在實際操作中,藍白篩選出現是淺藍色重組子的原因是：插入小片段時，質粒仍可以表達有缺陷N-末端a肽與B連互補形成活力有缺陷的半乳糖苷酶 重組子形成淺藍斑。即而出現假陰性。
相關實驗方法
生物谷 >> 生物 >> 生物教程 >> 分子生物學技術 >>第五章重組質粒的連線、轉化及篩選
http://www.bioon.com/biology/biotech/78854.shtml
