胺基酸分析法
胺基酸分析法是指用於測定蛋白質、肽及其他藥物製劑的胺基酸組成或含量的方法。根據胺基酸組成分析可以對蛋白質及肽進行鑑別，胺基酸分析法可用於確定蛋白質、肽及胺基酸的含量，及測定可能存在於蛋白質及肽中的非典型胺基酸。進行胺基酸分析前，必須將蛋白質及肽水解成單個胺基酸，具體水解方法由各品種項下規定。蛋白質及肽水解後，其胺基酸分析過程與用於其他藥物製劑中游離胺基酸的分析過程相同。
本法包括四種柱前衍生法，分別為異硫氰酸苯酯（PITC）法、6-氨基喹啉－N－羥基琥珀醯亞氨基氨基甲酸酯（AQC）法、鄰苯二醛（OPA）和9-芴甲基氯甲酸甲酯（FMOC）法、2，4-二硝基氟苯（DNFB）法，以及一種茚三酮柱後衍生法。不同的品種應針對自身所含的胺基酸種類及各胺基酸的含量選擇適宜的胺基酸分析方法並做相應的方法學驗證。
由於本法衍生過程中衍生溶液量較少，且容易揮發，外標法極易出現較大的誤差，建議採用內標法進行測定，內標的確定由各品種項下規定。在本法中，由於半胱氨酸或胱氨酸的衍生產物不穩定，因此對於含半胱氨酸或胱氨酸的樣品衍生後應儘快測定，或者在衍生前對半胱氨酸或胱氨酸進行適當的處理，使其轉化為穩定地產物（如磺基丙氨酸或半胱氨酸-硫代丙酸）後再衍生測定，具體方法由各品種項下規定。在測定過程中，可根據所用的儀器、色譜柱品牌、色譜柱的長度及要分離的胺基酸種類，對流動相的有機溶劑和洗脫梯度作適當調整以獲得較好的分離度。
第一法 PITC柱前衍生胺基酸分析法
本法系根據胺基酸與異硫氰酸苯酯（PITC）反應，生成有紫外回響的胺基酸衍生物苯氨基硫甲醯胺基酸（PTC-胺基酸），PTC-胺基酸經反相高效液相色譜分離後用紫外檢測，在一定的範圍內其吸光值與胺基酸濃度成正比。本方法的線性濃度範圍為0.025～1.25µmol/ml。試劑 （1）流動相A0.1mol/L醋酸鈉溶液(取無水醋酸鈉8.2g，加水900ml溶解，用冰醋酸調pH至6.5，然後加水至1000 ml)-乙腈(93:7)。
（2）流動相B 乙腈－水（8：2）。
對照品溶液按各品種項下規定的方法製備。
供試品溶液按各品種項下規定的方法製備。
色譜條件與系統適用性試驗 用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑（4.6×250mm， 5μm）；流速為每分鐘1.0ml；柱溫為40℃；檢測波長為254nm。各胺基酸峰間的分離度均應大於1.0。洗脫梯度如下：
時間(min) | 流動相A（%） | 流動相B（%） |
0 | 100 | 0 |
14 | 85 | 15 |
29 | 66 | 34 |
30 | 0 | 100 |
37 | 0 | 100 |
37.1 | 100 | 0 |
45 | 100 | 0 |
測定法 精密量取胺基酸對照品溶液200μl，置一2ml塑膠離心管中，精密加入1mol/L三乙胺乙腈溶液100μl，混勻，精密加入0.1mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液100μl，混勻，室溫放置1小時，加0.8ml正己烷，劇烈振搖，放置10min，精密取下層溶液2μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液200μl，自“置一2ml塑膠離心管中”起同法測定。
第二法 AQC柱前衍生胺基酸分析法
本法系根據胺基酸與6－氨基喹啉－N－羥基琥珀醯亞氨基氨基甲酸酯（AQC）反應，生成有紫外與螢光回響的不對稱尿素衍生物（AQC-胺基酸），AQC-胺基酸經反相高效液相色譜後用紫外或螢光檢測，在一定的範圍內其吸光值與胺基酸濃度成正比。本方法的線性濃度範圍為2.5～200nmol/ml。試劑 （1）流動相A 取醋酸銨10.8g或無水醋酸鈉11.5g，加水900ml溶解，用磷酸調pH至5.0，然後加水至1000 ml。
（2）流動相B 乙腈－水（3：2）。
（3）0.4 mol/L 硼酸鹽緩衝液(pH 8.8) 取硼酸12.36g，加水400ml溶解，用40%氫氧化鈉溶液調pH至8.8，然後加水稀釋至500ml。
(4) AQC溶液取AQC適量，加乙腈溶解並稀釋製成每1ml中含1mg的溶液。
對照品溶液按各品種項下規定的方法製備。
供試品溶液 按各品種項下規定的方法製備。
色譜條件與系統適用新試驗 用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑（4.6×250mm， 5μm）；流速為每分鐘1.4ml；柱溫為37℃；檢測波長為248nm。各胺基酸峰間的分離度均應大於1.0。洗脫梯度如下：
時間(min) | 流動相A（%） | 流動相B（%） |
0 | 88 | 12 |
14 | 88 | 12 |
29 | 80 | 20 |
30 | 59 | 41 |
37 | 59 | 41 |
37.1 | 88 | 12 |
45 | 88 | 12 |
測定法 精密量取對照品溶液10μl，置一直徑為0.4cm、高度為5cm的小試管中，精密加入0. 4 mol/L 硼酸鹽緩衝液(pH 8.8) 70μl，在渦鏇混勻器上混勻，精密加入AQC溶液20μl，混勻，精密量取5μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液10μl，自“置一直徑為0.4cm”起同法測定。
第三法 OPA和FMOC柱前衍生胺基酸分析法
本法系根據一級胺基酸，在巰基試劑存在下，首先與鄰苯二醛（OPA）反應，生成OPA-胺基酸；反應完畢後，加入9-芴甲基氯甲酸甲酯（FMOC），剩餘的二級胺基酸與FMOC繼續反應，生成FMOC-胺基酸，兩次反應生成的胺基酸衍生物經反相高效液相色譜分離後用紫外或螢光檢測，在一定的範圍內其吸光值與胺基酸濃度成正比。本方法的線性濃度範圍為0.025～2.5µmol/ml。試劑 （1）流動相A 稱取醋酸鈉7.5g，加水4000ml溶解，加三乙胺800μl，四氫呋喃24ml，混勻，用2%醋酸調pH至7.2。
（2）流動相B 稱取醋酸鈉10.88g，加水800ml溶解，用2%醋酸調pH至7.2，加乙腈1400ml，甲醇1800ml，混勻。
（3）0.4 mol/L 硼酸鹽緩衝液(pH 10.4) 取硼酸24.73g，加水800ml溶解，用40%氫氧化鈉溶液調pH至10.4，然後加水稀釋至1000ml。
（4）OPA溶液 取 OPA 80mg，加0.4 mol/L 硼酸鹽緩衝液(pH 10.4) 7ml，加乙腈1ml， 3-巰基丙酸125μl ，混勻 。
（5）FMOC溶液 取FMOC 40mg , 加乙腈8ml溶解。
對照品溶液按各品種項下規定的方法製備。
供試品溶液 按各品種項下規定的方法製備。
色譜條件與系統適用性試驗 用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑（4.6×150mm， 5μm）；柱溫為40℃；檢測波長為338nm（一級胺基酸），262nm（二級胺基酸）。各胺基酸峰間的分離度均應大於1.0。洗脫梯度及流速如下：
時間(min) | 流動相A（%） | 流動相B（%） | 流速（ml/min） |
0.0 | 100 | 0 | 1.0 |
17.0 | 50 | 50 | 1.0 |
45.0 | 0 | 100 | 1.0 |
45.1 | 0 | 100 | 1.5 |
50.0 | 0 | 100 | 1.5 |
50.1 | 100 | 0 | 1.0 |
53 | 100 | 0 | 1.0 |
測定法 精密量取對照品溶液50μl，置一1.5ml塑膠離心管中， 精密加入0. 4 mol/L 硼酸鹽緩衝液(pH 10.2) 250μl，混勻，精密加OPA衍生劑50μl，混勻，放置30秒，精密加入FMOC衍生劑50μl，混勻，精密量取4μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液50μl，自“置一1.5ml塑膠離心管中”起同法測定。
附註：1、由於OPA-胺基酸不穩定，因此衍生後應立即進行分離測定。
2、本方法的衍生過程也可由自動進樣器完成。
第四法 DNFB柱前衍生胺基酸分析法
本法系根據胺基酸與2,4-二硝基氟苯（DNFB）反應，生成有紫外回響的二硝基苯-胺基酸（DNP-胺基酸），DNP-胺基酸經反相高效液相色譜分離後採用紫外檢測，在一定的範圍內其吸光值與胺基酸濃度成正比。本方法的線性回響範圍為30～140 pmol。本法所用的2，4－二硝基氟苯屬易爆、劇毒物質，有強致癌性，且該法對色譜柱要求較高，易損壞色譜柱，衍生試劑水解生成的2，4-二硝基苯易干擾絲氨酸的測定。除另有規定外，一般不宜採用本法。試劑 （1）流動相A） 0.05mol/L醋酸鈉溶液(取 4.1g無水醋酸鈉，加水800ml溶解，加二甲基甲醯胺10ml，用稀醋酸調pH至6.4，用水稀釋至1000 ml)。
（2）流動相B 流動相A-乙腈（1：1）。
對照品溶液按各品種項下規定的方法製備。
供試品溶液按各品種項下規定的方法製備。
色譜條件與系統適用新試驗 用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑（4.6×250mm， 5μm）；流速為每分鐘1.0ml；柱溫為40℃；檢測波長為360nm。各胺基酸峰間的分離度均應大於1.0。洗脫梯度如下：
時間(min) | 流動相A（%） | 流動相B（%） |
0 | 75 | 25 |
6 | 75 | 25 |
6.1 | 65 | 35 |
11 | 59 | 41 |
14 | 59 | 41 |
14.1 | 50 | 50 |
22 | 45 | 55 |
32 | 10 | 90 |
37 | 10 | 90 |
39 | 75 | 25 |
50 | 75 | 25 |
測定法 精密量取胺基酸對照品溶液2ml，置一50ml量瓶中，加0.5mol/L碳酸氫鈉溶液2ml，2，4-二硝基氟苯衍生化試劑（量取2，4－二硝基氟苯1ml ，用乙腈稀釋至100ml）1ml，混勻，在60℃水浴中反應 1小時，取20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液2ml，自“置一50ml量瓶中”起同法測定。
第五法 茚三酮柱後衍生胺基酸分析法
本法系根據胺基酸經陽離子交換色譜柱分離後，與茚三酮反應，一級胺基酸生成在570nm處具有最大吸收的紫色化合物，二級胺基酸（如脯氨酸）生成在440nm具有最大吸收的黃色化合物，分別在570nm和440nm下檢測上述反應產物，在一定的範圍內其吸光值與胺基酸濃度成正比。本方法的線性回響範圍為20～500 pmol。試劑 （1）流動相A 取無水檸檬酸鈉1.7g，鹽酸1.5ml，加水溶解並稀釋至100ml，用鹽酸調pH至3.0。
（2）流動相B 取無水檸檬酸鈉1.7g，鹽酸0.7ml，加水溶解並稀釋至100ml，用鹽酸調pH至4.3。
（3）流動相C 取氯化鈉5g，無水檸檬酸鈉1.9g，苯酚0.1g，加水溶解並稀釋至100ml，用鹽酸調pH至6.0。
（4） 色譜柱再生溶液 取氫氧化鈉0.8g，加水溶解並稀釋至100ml，用鹽酸調pH至13。
（5）柱後衍生試劑取茚三酮18g，茚氮蘭0.7g，加76.7%二甲基亞碸－0.7二水合醋酸鋰－0.1%醋酸溶液900ml使溶解，在氮氣下混合至少3小時。
（6）樣品緩衝液 2%無水檸檬酸鈉-1%鹽酸-0.5%硫代二乙醇－0.1%苯甲酸溶液。
對照品溶液按各品種項下規定的方法製備。
供試品溶液按各品種項下規定的方法製備。
色譜條件與系統適用新試驗 用磺化苯乙烯－二乙烯苯共聚物為填充劑（4.0×120mm， 7.5μm）；流動相流速為每小時14.0ml；柱後衍生試劑得流速為每分鐘7ml，反應器溫度為135℃；檢測波長為440nm(一級胺基酸)，570nm（二級胺基酸）。各胺基酸峰間的分離度均應大於1.0。洗脫梯度如下：開始時用流動相A平衡色譜柱，在25分鐘流動相的組成變為100%流動相B，在37分鐘，流動相組成變為100%流動相C，在75min，最後一個胺基酸被洗脫後，用色譜柱再生溶液再生色譜柱1分鐘。柱溫程式如下：開始時柱溫48℃，11.5分鐘後，以每分鐘3℃的速率升至65℃，約35分鐘後，以每分鐘3℃的速率升至77℃，最後在約52分鐘後，以每分鐘3℃的速率降至77℃。
測定法 精密量取胺基酸對照品溶液適量，注入胺基酸分析儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液適量，同法測定。
附註：不同品牌的胺基酸分析儀，應根據儀器的要求，對流動相、色譜柱再生溶液、衍生試劑、緩衝液和洗脫梯度作適當調整。
