崇禎無年（1628年），任戶科經事中，這種官職的設立，原意是對政府部門起一定監察作用，他覺得可以舒展抱負了。七個月里，連上二十多封奏疏，他竭力主張：要挽回危局，必須“回本清源”，抨擊還高居相位的魏忠賢餘黨，為被害人昭雪，扶持正氣。對朝政設施，多所建白。當時，滿洲貴族努爾哈赤自稱“滿洲汗”“後金”（以後改稱“清”），和明王朝分庭抗禮，不斷向南入侵。式耜早有警覺，連上好幾封奏疏，要求
增儲軍糧，教練士兵修好邊牆，講求武備，舉薦徐光啟、李之藻、孫元化等一批能臣。可是瞿式耜的行動觸犯了當權者的利益。卻遭到溫體仁、周延儒等排擠陷害，不久，被削職回家。
崇禎十七年（1644年）三月，農民起義軍攻下北京，崇禎帝在煤山自殺。滿洲貴族趁吳三桂借兵機會，大舉進入山海關。農民軍措手不及，退出北京。五月，清順治帝進入北京，開始武力征服全中國。與此同時，明福王朱由崧在南京建立弘光政權。瞿式耜被任命為廣西巡撫。瞿式耜認為，廣西在祖國西南一角，山重水複，進可以攻，退可以守，是舉足輕重的戰略要地，就帶著邵氏夫人向廣西進發。半路上，南京陷落，到處人心惶惶。到梧州上任，他督促生產，勸告人民安心耕種；一面招募士兵，認真訓練，修築城堡，加強防守。在短短時間裡，浮動的人心，逐漸安定下來。
繼弘光以後，明唐王朱聿鍵在福州建立隆武政權，繼續抗清。不意在桂林的靖江王朱亨嘉不承認隆武政權，自稱“監國”，建立小朝廷。派人拉攏瞿式耜。被式耜嚴詞拒絕，寫信責備亨嘉：國家正處在千鈞一髮的時候，福建已立帝復國，應該齊心協力挽救危難，怎能鶴蚌相爭，還通知少數民族的武裝力量，又遭拒絕，不禁惱羞成怒，帶兵趕到梧州，用武力威脅。式耜被橫拖倒曳，還是面不改色，斥責那種罪惡行徑。於是，被帶回桂林，囚禁起來。
隆武政權的軍隊，把亨嘉打得走投無路。亨嘉困桂林，只得勸說式耜協助守城。式耜聯絡好亨嘉的軍官焦璉，和城外軍隊取得聯繫，時應外合，把亨嘉擒獲。這次分裂活動被粉碎了。
隆武二年（1646年）八月，清兵破汀州，隆武帝被殺。訊息傳來，瞿式耜和大臣們擁立桂王朱由榔做皇帝，年號“永曆”。原意希望他能發奮圖強，抗擊清兵，收復失地。哪知朱由榔是個怯懦無能，貪生怕死的“逃跑天子”。敵兵遠在幾百里外，一有警報，就溜之大吉。有一次，由榔在桂林，聽到平樂被襲，馬上要逃到全州。式耜反覆勸說，甚至痛哭流涕也不聽。臨走時，要式耜一起走。式耜說：“皇上要我一起走，是對我關心，但我負有保衛桂林的責任，就是為它犧牲，也心甘情願。”自請留守桂林。在那樣艱苦歲月里，他不動搖，不後退，沉著指揮，依靠軍民團結，短短的十四個月里，抗擊了清兵三次對桂林的進犯。第一次，永曆元年（1403年）三月，清兵已攻陷平樂，式耜估計敵人必然要爭奪桂林，一面調度糧草，一面把駐在黃沙鎮的焦璉部隊調回桂林。式耜把自已俸銀也湊上去犒賞將士。冷不防第二天上午清兵突然襲擊桂林，攻入文昌門。式耜沉著指揮，依靠焦璉、白貴、白玉等部隊奮勇廝殺，清兵全面潰退。第二次， 就在那年五月，奉命到桂林駐防的劉承胤部和焦璉部發生磨擦，劉部大掠桂林而去，焦部也出駐白石潭。式耜估計形勢危急，促焦璉回城，並把久雨淋壞的城牆缺口修復，要他們協力同心，嚴加防守。清兵偵知桂林已是空城，又在兵變之後，人心惶惶，就再一次襲擊桂林。滿以為這一下子不費吹灰之力可占桂林，因此不但把準備奪下城池後的官吏委派停當，連一切套用什物也帶了來。沒想到式耜從容指揮，分門防守，發炮轟擊城外敵兵，自早到午，連續作戰。式耜帶領守城官吏，把存儲的糧食，蒸成飯，送到前線。第二天清晨，焦璉率部隊冒雨出擊，出乎敵兵意外，棄甲丟盔，紛紛逃竄。預伏在隔江的軍隊，炮銃齊發。清兵被打得落花
流水，望到山上樹木，也當作明朝軍隊，真所謂“草木皆兵”了。第三次是永曆二年（1648年）。那年二月，聯明抗清的農民軍將領郝永忠，在靈川戰役中受挫，退到桂林，受到當發駐軍的歧視，發生了所謂“二月兵變”，事態擴大了，永忠還派軍官保護瞿式耜。以後，發展到不可收拾的地步。式耜也只得退駐樟木港。三月初回城，料理善後事宜，首先是安定人心，加強戰備。督師何騰蛟帶兵來保衛桂林。二十二日，清兵果然又一次進犯桂林。式耜和騰蛟研究作戰方略，指揮三路出擊，將士奮不顧身，反覆衝殺，清兵全面潰退。
桂林幾次轉危為安，大大發定了民心，鼓舞了鬥志。式耜當時以大學士兼吏、兵兩部尚書，力主調和主客，聯合農民軍共同抗清，又由於何騰蛟指揮得當，各路軍隊相互配合，取得了麻河、全州等幾次大戰役的勝利；降清將領金聲桓、李成棟等先後反正，聲勢稍振。就是何騰蛟殉國後，式耜兼任督師時，還陸續收復靖州、沅州、武岡、室慶等府縣。無奈小朝延里仍名是爭權奪利，猜忌傾軋，甚至企圖牽制式耜；部隊又長期戰鬥。得不到休整，大大削弱了戰鬥力。
永曆四年（1650年），全州再度陷落，嚴關失守，前線潰退下來的官軍，沿途擄掠，秩序大亂。駐城將領不戰而逃。式耜氣憤到極點，捶胸頓足說：“國家把高官厚祿給這些人，現在這般行徑，可恥！可恥！”形勢越來越壞，男女僕從也走散了。他的侍從武官備馬請他出城暫，勸他說：“大人是國家棟樑，一身關係國家安危，突圍出去，還可號召四方愛國志士，再幹大事。”又說：“二公子（玄銷）經歷千難萬苦，從常熟趕來看大人，只需暫避一下，父子就能見面了。”式耜揮揮手說：“我是留守，我沒有守好這個地方，對不起國家，還顧什麼子女！”整整衣冠，端坐在衙門裡。總督張同敞（前首輔張居正孫），從靈川回桂林，聽說城裡人已走空，只有瞿式耜沒走。同敞平時十分敬重瞿式耜，知道他的為人， 意識到他已抱定殉國的決心，立即泅水過江，趕到留守衙門，見式耜說：“形勢這么危急，你怎么辦?”式耜說，“我是留守，有責任守好這地方，‘城存與，城亡與亡’。今天，為國家而死，死得光明磊落。你不是留守，為什麼不走？””同敞聽了，突然嚴肅起來，說：“要死，就一起死，老師，你難道不允許我和你一起殉難嗎？就在旁邊椅子上.坐下來，和式耜一起飲酒，談笑自若。東方漸漸發白，清兵衝進衙門，要捆綁他們。式耜說：“我們不怕死，坐等一夜了，用不著捆綁。”和同敞昂首闊步走出衙門。這次攻陷桂林的是清定南王孔有德，是降清的明朝登州守將。他一心想收降式瞿式耜，那年正月，曾寫信勸降。瞿式耜焚書斬使”，作了明確答覆。這次聽到式耜被俘，很高興，看到瞿式耜進來，讚嘆著說：“你是瞿閣部嗎?好閣部!”式耜笑笑說：“你是王子嗎?好王子!”這是有意嘲諷他降清接受定南王封號。孔有德還是和顏悅色的勸降，反覆引譬，都被式耜嚴詞拒絕。孔不認識張同敞，要他脆。同敞不脆，反而揭孔的老底，破口大罵。孔惱羞成怒，打同敞耳光；手下的衛士，有的撳同敞頸椎骨，要他低頭；有的用刀背敲同敞膝骨，要他下跪。臂骨被打折，一隻眼睛被打瞎……。式耜看到這種暴行，遏制不住心頭憤怒，挺身遮住同敞大聲說“這是總督張同敞是國家大臣，他和我一樣抱定為國犧牲的決心，要死，我們一起死，不得無禮!”孔有德知道一時無法勸說，命令把兩人囚禁在風洞山（今稱迭彩山）臨時監獄裡。
瞿式耜在囚室里，孔有德仍然不止一次地派人勸降，都被拒絕。他寫了不少詩，突出地反映了堅貞不屈的民族氣節以及忠貞不渝，為國獻身的精神，與同敞唱和，有名的《浩氣吟》，就是在這種情況下寫成的。在詩里，他把自己比做漢朝時身陷匈奴，冰天雪地中苦熬十九年而不屈的蘇武，比做南宋末年支撐半壁江山，抗擊元朝軍隊，終於力盡被俘、殺身成仁的文天祥。他把自己生死置之度外，卻念念不忘國家的抗清大業。他
寫了一封密信給焦璉，告訴他清兵在桂林的虛實情況，要他迅速襲擊桂林。恐怕因自己囚禁而焦璉所顧慮，又叮囑說：“事關中興大計，不要考慮我個人得失。”這封信被巡邏兵搜獲，獻給孔有德，孔知道無法改變他報國的決心了。
閏十一月十七日上午，幾個清兵，到囚室來要他們出去。式耜看到這情況，心裡明白，面不改色，寫下一首絕命詩，連同《浩氣吟》詩稿放在矮桌上，從容走出獄門。遇到張同敞，同敞說：“今天出去，其痛快!死得好!”兩人視死如歸的英雄氣概，連清兵也感動得流下淚來。兩人在仙鶴岩（風洞山南），慷既就義。式耜殉國後，永曆朝給謚“文忠”。永曆六年（1652年）七月，聯明抗清的原農民軍將領李定國收復桂林，罪大惡極的民族敗類孔有德自知罪孽深重，畏罪自殺。李定國為瞿式耜立祠紀念，並召見其孫瞿昌文，支持昌文為祖父歸葬故鄉虞山拂水岩牛窩潭。解放後，該墓列入江蘇省文物保護單位。
桂林人民敬仰瞿、張二公，立有專祠。道光時，在兩公成仁處立石紀念。1959年，重修仰止堂，並立碑紀念。碑文介紹了兩公簡要事跡，最後寫道：“桂人感二公之節，為建雙忠祠，歲時祭祀。二公俠骨錚錚，義風烈烈，將與八桂名山共垂不朽。”
瞿式耜著有詩文十卷，道光十五年（1835年）有木刻本 《瞿忠宣公集》。1981年，上海古籍出版社增補校訂出版改稱，《瞿式耜集》。1986年出版的《中國大百科全書·中國文學》有“瞿式耜”專條，稱讚他的詩作，“充滿著激越的愛國熱情”，中國文學史把式耜列入愛國詩人行列，他是當之無愧的。
