mRNA減法雜交(subtractive hybridization)技術又叫做差減cDNA克隆。它是通過構建差減文庫(subtractive library)得以實現的。
定義:
減法雜交是用過量的參照細胞的mRNA或cDNA與目的細胞的cDNA或mRNA(又稱目的序列)雜交,形成的RNA-cDNA雜交體是兩種細胞共有的,將其扣除。剩下的cDNA或mRNA可以標記成探針(稱減法或扣除探針),從前述的目的細胞的cDNA文庫中篩選目的克隆;還可以用來構建文庫,即減法文庫。減法文庫實質上是除去了一大批高豐度非特異性的cDNA。文庫中含有的是特異表達的cDNA克隆及其他一些低豐度的mRNA的cDNA克隆。
原理:
減法雜交的本質是除去那些普遍共同存在的cDNA序列,從而使欲分離的目的基因的序列得到有效的富集,提高了分離的敏感性。減法雜交工作原理:從表達目的基因的組織(以下簡稱[+]提取mRNA所轉錄為cDNA,然後與無目的基因表達的組織(簡稱[-])提取的mRNA做過量雜交,在[+]、[-]組織中均表達的基因產物形成cDNA/mRNA雙鏈雜交分子,而特異mRNA反轉錄的cDNA仍保持單鏈狀態,將這種單鏈cDNA分離出來即為差異表達的序列。
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