活力檢查

活力檢查

調製好的生產發酵劑在投產使用前需要進行品質鑑定,合乎要求才可使用。包括感官檢查、細菌學檢查、化學檢查和活力檢查。 活力檢查是以乳酸菌產酸和抑菌能力確定發酵劑的活力。產酸能力可評價乳酸菌的產酸速率和產酸量;抑菌能力可評價乳酸菌抑制常見致病菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的能力。

發酵劑品質鑑定

調製好的生產發酵劑在投產使用前需要進行品質鑑定,合乎要求才可使用。

感官檢查

觀察發酵劑的質地、組織狀態、凝固性狀與乳清析出情況,味道與色澤。品質好的發酵劑應乳凝固均勻、細膩和緻密,無塊狀物,用手輕擊器壁時有一定彈性,沒有乳清析出或析出得少,具有誘人的芳香酸味,無異味,氣泡和色澤變化。品質差的發酵劑出現乳凝固不結實,質地不均勻緻密,乳清析出過多。其原因是①乳中乾物質含量低(乾物質不能低於21%);②培養溫度不適當或培養時間過長;③雜菌污染。此外異味與氣泡的出現亦主要是污染雜菌的緣故。

細菌學檢查

主要檢查發酵劑內乳酸菌總菌數與雜菌污染。首先採用顯微鏡直接計數法計算總菌數,而後用乳清培養基以菌落計數法檢查活菌數。品質好的發酵劑,活菌數不應低於10^9個/mL。

化學檢查

主要檢查酸度與揮發酸。含生香菌的發酵劑需檢查丁二酮。

活力檢查

以乳酸菌產酸和抑菌能力確定發酵劑的活力 。

乳酸菌產酸能力

產酸速率快的乳酸菌的篩選

斜面保藏的乳酸菌活化後用0.85%無菌生理鹽水洗菌兩次,製備成菌懸液後按照2%的接種量接入發酵培養基中置於25℃培養箱中厭氧培養,定期取樣測定pH值。以從商品泡菜湘飄飄爽口蘿蔔頭中分離的乳酸菌中產酸最快的菌株CK1做為對照菌株。

高產酸量的乳酸菌的篩選

將斜面保藏的乳酸菌活化兩次並擴大培養後用0.85%無菌生理鹽水洗菌兩次製備成菌懸液,按照2%的接種量接入發酵培養基中置於25℃培養箱中厭氧培養,發酵72h後取樣採用酸鹼滴定法測定總酸含量。以從商品中分離的乳酸菌CK1做為對照菌株。

酸鹼滴定法測定總酸量具體操作如下:

(1)氫氧化鈉(NaOH)標準滴定溶液的配置:稱取110.00g氫氧化鈉,溶於100mL無CO2的蒸餾水(將蒸餾水超聲處理即為無CO2的蒸餾水)中,搖勻,密閉放置至溶液澄清。量取54mL澄清NaOH溶液用不含CO2的蒸餾水定容至1000mL,混勻,即配置成0.1mol/L的NaOH標準滴定溶液,備用;

(2)0.1mol/L的NaOH標準滴定溶液的標定:稱取0.7500g烘至恆重的鄰苯二甲酸氫鉀,溶於50mL無CO2的蒸餾水中,用0.1mol/L的NaOH標準滴定溶液滴定至粉紅色且30s不褪色。按下列公式計算:

C(NaOH)=m×1000/(V1-V2)M,

其中m—鄰苯二甲酸氫鉀的準確數值(g);V1—滴定用NaOH溶液的體積(mL);V2—空白實驗用NaOH溶液的體積(mL);M—鄰苯二甲酸氫鉀的摩爾質量(g/mol)[M(KHC8H4O4)=204.22]。

(4)產總酸量的測定:取發酵72h發酵上清液1mL,用無CO2的蒸餾水稀釋10倍,再滴加2滴酚酞指示劑,用標定好的0.01mol/LNaOH滴定溶液滴定至粉紅色,且30s內不褪色,記錄NaOH溶液消耗量,各做兩次平行。對照組為10mL無CO2的蒸餾水。總酸計算公式:

總酸(g/100mL)=[C2×(V3-V4)×K×F]×100/V,

其中C2—NaOH標準滴定溶液的準確數值(mol/L);V3—滴定用NaOH溶液的體積(mL);V4—空白實驗用NaOH溶液的體積(mL);K—酸的換算係數,乳酸0.090;F—試液的稀釋倍數;V—試樣的體積(mL)。

乳酸菌抑菌能力

抑制大腸桿菌能力較強的菌株的篩選

(1)乳酸菌的活化:取斜面保藏的乳酸菌於MRS肉湯培養基中活化兩次後,按照2%的接種量接種於MRS肉湯培養基中,置於37℃恆溫培養箱中厭氧培養24h後離心(8000rpm,20min,4℃)取上清液,一部分用於測定其pH值,一部分過無菌0.22μm濾膜後保存於無菌容器中放置在4℃冰櫃中用於抑菌試驗。

(2)指示菌的製備:取斜面保藏大腸桿菌E.coli ATCC 8739接種於TSB培養基中,在37℃,160r/min的條件下活化兩次,然後按照2%的的接種量接入TSB培養基中搖瓶培養6h,使菌液濃度達10^9cfu/mL。分別取原濃度菌液和稀釋至10^7cfu/mL的菌液取400μL塗布於營養瓊脂平板上至無流動的液體為止。

(3)發酵上清液(cell-free supernatant,CFS)抑菌試驗:採用牛津杯法(劉冬梅等2006)研究CFS抑制E.coli ATCC 8739的能力。將E.coli ATCC 8739活化兩次後取400μL塗平板,在每個平板上均勻放置3個已經經滅菌的牛津杯,再向牛津杯中緩慢加入200μL無菌CFS,一半直接置於37℃培養箱中培養24h後測定抑菌圈的直徑,一半於4℃冰櫃中擴散24h後置於37℃培養箱中培養24h,測定抑菌圈的直徑d。根據抑菌圈的大小篩選抑制大腸桿菌E.coli ATCC 8739能力較強的乳酸菌。

抑制金黃色葡萄球菌能力較強的菌株的篩選

(1)菌種的活化:取斜面保藏的乳酸菌於MRS肉湯培養基中活化兩次後,按照2%的接種量接種於MRS肉湯培養基中,置於37℃恆溫培養箱中厭氧培養24h後離心(8000rpm,20min,4℃)取上清液,一部分用於測定其pH值,一部分過無菌0.22μm濾膜後保存於無菌容器中放置在4℃冰櫃中用於抑菌試驗。

(2)指示菌的製備:取斜面保藏大腸桿菌金黃色葡萄球菌S.aureus ATCC 29213接種於TSB培養基中,在37℃,160r/min的條件下活化兩次,然後按照2%的的接種量接入TSB培養基中搖瓶培養8h,使菌液濃度達10^9cfu/mL。分別取原濃度菌液和稀釋至10^7cfu/mL的菌液取400μL塗布於營養瓊脂平板上至無流動的液體為止。

(3)CFS抑菌試驗:將S.aureus ATCC 29213活化兩次後取400μL塗平板,在每個平板上均勻放置3個已經經滅菌的牛津杯,再向牛津杯中緩慢加入200μLCFS,一半直接置於37℃培養箱中培養24h後測定抑菌圈的直徑,一半於4℃冰櫃中擴散24h後置於37℃培養箱中培養24h,測定抑菌圈的直徑d。根據抑菌圈的大小篩選抑制金黃色葡萄球菌S.aureus ATCC 29213能力較強的乳酸菌 。

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