層析分離法的概念
層析分離法，簡稱層析法，又稱色譜法、色層法或層離法（Chromatography），是一種套用很廣的分離分析方法。1903年，俄國的植物學家M，C．UBeT在研究分離植物色素過程中，首先創造了色譜法，這是一種根據化合物的不同結構和不同的物理，化學特性，從而具有不同吸附性能的原理，以分離混合物中的化學成分的一種物理化學分離方法，最初用於有色物質，之後套用於大量的無色物質。色譜法的名稱雖然仍然沿用，但已失去原來的含義。層析法和其他分離方法比較，具有分離效率高，操作又不太麻煩的優點。因此，層析法的套用越來越廣，對於近代化學科學的發展有巨大的影響。在製藥、化工、農業、醫學等方面都有著廣泛的套用。
層析法的歷史及原理
層析法的歷史
1903年3月21日俄國植物學家茨維特（Michael Tswett，1872-1919）在華沙自然科學學會生物學會議上發表了“一種新型吸附現象及其在生化分析上的套用”研究論文，介紹了一種套用吸附原理分離植物色素的新方法，並首先認識到這種層析現象在分離分析方面有重大價值。1906年他在德國植物學雜誌發表文章，首次命名上述分離後色帶為色譜圖，稱此方法為色譜法（Chromatography）。1907年在德國生物學會年會上，展示過帶有色帶的分離柱管和純化過的植物色素溶液。茨維特被世人公認為色譜創始人。
德籍奧地利化學家R.Kuhn 等利用他的方法在纖維狀氧化鋁和碳酸鈣的吸附柱上將過去一個世紀以來公認為單一的結晶狀胡蘿蔔素分離成a 和b 兩個同分異構體，並由所取得的純胡蘿蔔素確定出了其分子式。 Kuhn正是由於在維生素和胡蘿蔔素的離析與結構分析中取得了重大研究成果而獲得了1938年諾貝爾化學獎。
1952年，Martin和James發表第一篇氣液色譜論文，首次用氣體作流動相，配合微量酸鹼滴定，發明了氣相色譜，它給揮發性化合物的分離測定帶來了劃時代的革命 。
層析法的原理
層析法利用混合物中各組分的物理化學性質間的差異（溶解度、分子極性、分子大小、分子形狀、吸附能力、分子親合力等），使各組分在支持物上集中分布在不同區域，藉此將各組分分離。
層析法進行時有兩個相，一個相稱為固定相，另一相稱為流動相。由於各組分所受固定相的阻力和流動相的推力影響不同，各組分移動速度也各異，從而使各組分得到分離。
層析技術與待分離混合物中各組分的理化性質（分子自然形狀、大小、獲電狀態、溶解度與選擇性吸附劑或載體物的吸附能力，分配係數、酸鹼環境、溫度、極性以及分子的親和能力等）有著直接關係。除此，任何層析技術，均具有兩相條件，造成流動相對固定相作單向相對運動。這種流動相推動樣品中各組分通過固定相向前遷移，其運動速率與兩相物質和被分離物質狀態有關。由於被分離物各組分中的理化性質不同，對不同的兩組或兩組以上組分，具有不同的作用力，通過吸附一解吸，或離子交換、分子篩效應、靜電引力，免疫特異性吸附等，造成各組間生物分子分離、遷移距離不等，最終達到被測物的分離、純化的目的。這一技術的套用，不但能分離有機化合物，還能分離無機物，更主要的是適合於分離分析生物高分子物質，其分離範圍廣，適用性強。化學性穩定、靈敏度高，既可純化又可製備，條件簡便。
層析法分類
層析法分類如下表所示 ：
| 分類原則 | 類型 | 特徵 |
| 據溶質分子與固定相相互作用的機理不同 | 吸附色譜 離子交換色譜 疏水作用層 金屬螯合色譜 共價作用色譜 分配色譜 凝膠過濾 親和色譜 | 吸附力不同 各物質與固定相之間的離子交換能力的不同 各物質與固定相之間的疏水作用的強弱不同 各物質與固定相上的金屬離子的絡合能力的不同 巰基化合物的巰基與固定相表面的二硫鍵作用力不同 各物質在兩液相間的分配係數不同 各物質的分子大小或形狀不同 利用生物大分子與各種配基的生物識別能力不同 |
| 據實驗技術 | 低壓色譜 中壓色譜 高壓色譜 電泳 | 操作壓力小於0.5 MPa 操作壓力在0.5～5 MPa之間 操作壓力在5～40 MPa之間 溶質分子在電場中的移動速度不同 |
| 據固定相的形狀不同 | 柱色譜 紙色譜 薄層色譜 | 固定相裝在玻璃、不鏽鋼或有機玻璃柱中 固定相為以氫鍵與纖維素羥基結合的水 固定相在玻璃平板上鋪成薄層 |
| 據流動相的物態不同 | 氣相色譜 液相色譜 超臨界流體色譜 | 流動相為氣體 流動相為液態 流動相為液態 |
| 按操作方式不同 | 迎頭法 頂替法 洗脫法 | 將混合物溶液連續通過固定相，只有化學親和力最弱的組分以純粹狀態最先流出，但其它各組分都不能達到分離。 利用一種化學親和力比各被結合組分都強的物質來洗脫，這種物質稱為頂替劑。此法處理量大，且各組分分層清楚，但層與層相連，故不能將組分分離完全。 將混合液儘量濃縮，使體積縮小，引入固定相的一端，然後用溶劑洗脫，洗脫溶劑可以是原來溶解混合物的溶劑，也可選用另外的溶劑。 |
幾種典型層析方法概念
吸附層析
利用吸附層析介質表面的活性分子或活性基團，對流動相中不同溶質產生吸附作用，利用其對不同溶質吸附能力的強弱而進行分離的一種方法，稱之為吸附層析。
分配層析
被分離組分在固定相和流動相中不斷發生吸附和解吸附的作用，在移動的過程中物質在兩相之間進行分配。利用被分離物質在兩相中分配係數的差異而進行分離的一種方法，稱之為分配層析。
離子交換層析
利用固定相介質表面活性基團，經化學鍵合方法，將具有交換能力的離子基團固定在固定相上面，這些離子基團可以與流動相中離子發生可逆性離子交換反應而進行分離，稱為離子交換層析。
凝膠層析
利用凝膠層析介質(固定相)交聯度的不同所形成的網狀孔徑的大小，在層析時能阻止比網孔直徑大的生物大分子通過。利用流動相中溶質的分子量大小差異而進行分離的一種方法，稱之為凝膠層析。
親和層析
在固定相載體表面偶聯具有特殊親和作用的配基，這些配基可以與流動相中溶質分子發生可逆的特異性結合而進行分離的一種方法，稱之為親和層析。
金屬螯合層析
利用固定相載體上偶聯的亞胺基乙二酸為配基與二價金屬離子發生螯合作用，結合在固定相上，二價金屬離子可以與流動相中含有的半胱氨酸、組氨酸、咪唑及其類似物發生特異螯合作用而進行分離的方法，稱之為金屬螯合層析。
疏水層析
利用固定相載體上偶聯的疏水性配基與流動相中的一些疏水分子發生可逆性結合而進行分離的方法，稱之為疏水層析。
反相層析
利用固定相載體上偶聯的疏水性較強的配基，在一定非極性的溶劑中能夠與溶劑中的疏水分子發生作用，以非極性配基為固定相，極性溶劑為流動相來分離不同極性的物質的方法，稱之為反相層析。
聚焦層析
利用固定相載體上偶聯的載體兩性電解質分子，在層析過程中所形成的pH梯度，並與流動相中不同等電點的分子發生聚焦反應進行分離的方法，稱之為聚焦層析。
灌注層析
利用剛性較強的層析介質顆粒中具有的不同大小貫穿孔與流動相中溶質分子分子量的差異進行分離的方法，稱之為灌注層析。
