基本信息
中華人民共和國農業部公告第2078號
根據《獸藥管理條例》和《獸藥註冊辦法》規定，我部組織制定了口蹄疫滅活疫苗內毒素和總蛋白測定法，現予發布，自發布之日起執行。
特此公告。
附屬檔案：1.口蹄疫滅活疫苗內毒素測定法
2.口蹄疫滅活疫苗總蛋白測定法
農業部
2014年3月12日
附屬檔案1 口蹄疫滅活疫苗內毒素測定法
吸取12 ml疫苗放入15 ml離心管中，置50±5℃水浴90分鐘，然後在4℃條件下，以15000 g離心10分鐘，取水相5.0 ml，按現行《中國獸藥典》一部附錄進行檢驗。每頭份疫苗中內毒素含量應不高於50 EU。
附屬檔案2 口蹄疫滅活疫苗總蛋白測定法
取1瓶疫苗恢復至室溫，在3個1.5ml離心管中分別精確加入100μl疫苗和900μl丙酮，充分混勻，室溫放置10分鐘，在4℃條件下，以15000g離心15分鐘。棄液相，沉澱物用400μl丙酮洗滌2次，室溫乾燥約15分鐘吸，加50μl去離子水復溶後，按附註進行檢驗。每毫升疫苗總蛋白含量應不高於500μg。
基本內容
附註：口蹄疫滅活疫苗總蛋白測定法1.方法與原理
本法適用於口蹄疫病毒油佐劑滅活疫苗總蛋白含量檢測。本法系福林酚法(lowry法)，依據蛋白質分子中含有的肽鍵在鹼性溶液中與Cμ2+螯合形成蛋白質－銅複合物，此複合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產生藍色化合物，同時在鹼性條件下酚試劑易被蛋白質中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸還原呈藍色反應。在一定範圍內其顏色深淺與蛋白質濃度呈正比，以蛋白質對照品溶液作標準曲線，採用比色法測定供試品中蛋白質的含量。
2.試劑與儀器
2.1試劑 丙酮（分析純）、無菌去離子水、商品化Lowry法改良試劑盒；
2.2設備 酶標儀（全波長），“Μ”型96孔板，卡介苗注射器，單通道和多通道移液器，渦鏇震盪儀，酶標板振盪器等。
3.操作步驟
3.1標準系列稀釋液製備 將商品化試劑盒內標準牛血清白蛋白（2mg/ml母液），按下表依次稀釋。
編號 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
母液（μl） | 0 | 5 | 25 | 50 | 100 | 150 | 200 | 300 | 400 |
去離子水（μl） | 400 | 395 | 375 | 350 | 300 | 250 | 200 | 100 | 0 |
終濃度（μg/ml） | 0 | 25 | 125 | 250 | 500 | 750 | 1000 | 1500 | 2000 |
3.2檢驗疫苗處理 取1瓶疫苗恢復至室溫搖勻後，在3個1.5 ml離心管中分別精確加入100μl疫苗和900μl丙酮，充分混勻，室溫放置10分鐘，在4℃條件下，以15000 g離心15分鐘。吸棄液相，沉澱物用400μl丙酮洗滌2次，室溫乾燥約15分鐘，加50μl去離子水復溶備用。
3.3反應板加樣與讀數
3.3.1各取3.1稀釋的各濃度牛血清白蛋白標準溶液40μl，以及三重複待檢疫苗樣品40μl，分別加入到96孔板內。用排槍迅速加入200μl改良lowry法試劑盒內試劑，立即用振盪器混勻30秒；
3.3.2封膜，室溫孵育10分鐘；
3.3.3各孔內分別加入20μl 1倍酚試劑（試劑盒內為2倍，用前用去離子水現稀釋），立即用振盪器混勻30秒；
3.3.4封膜，室溫孵育30分鐘；
3.3.5酶標儀測定750nm吸光值，保存讀數。
3.4數據處理
根據系列標準蛋白稀釋液的濃度（0μg/ml～2000μg/ml）和750nm吸光值，使用EXCEL以吸光值為X軸，以蛋白標準濃度為Y軸，繪製標準曲線，依據趨勢線求得多項式，其多項式R2≥0.98。
將被檢樣品的吸光值代入標準蛋白獲得的多項式，計算樣品中蛋白含量，根據取樣量求得1ml樣品中蛋白含量。例如口蹄疫滅活疫苗水相/油相比例為1:1，免疫劑量為2ml時，100μl疫苗經丙酮沉澱後用50μl去離子水復溶，測得濃度即為每頭份疫苗中蛋白濃度，或2ml疫苗中蛋白濃度。結果判定時，將測定值除以2即得每毫升疫苗中總蛋白含量。
3.5結果判定
若測定結果為每毫升疫苗總蛋白含量小於或等於500μg，則判定被檢疫苗總蛋白含量符合規定；若測定結果為每毫升疫苗總蛋白含量大於500μg，判定被檢疫苗總蛋白含量不符合規定。
3.6檢測數據處理舉例
3.6.1收集數據如表所示
Value | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
A | 0.102 | 0.149 | 0.336 | 0.504 | 0.836 | 1.122 | 1.334 | 1.702 | 1.923 | -- | -- | -- |
B | 0.677 | 1.722 | 0.252 | 1.116 | 2.167 | 1.020 | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
C | 0.640 | 1.704 | 0.230 | 1.050 | 2.195 | 0.962 | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
D | 0.641 | 1.716 | 0.225 | 1.061 | 2.175 | 1.012 | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
E | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
F | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
G | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
H | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
上述表格中，A1-A9為系列稀釋的標準牛血清白蛋白溶液，A1至A9蛋白濃度依次增高；B、C、D行中1-6列為檢測樣品750nm吸光值，B1-B6為6批不同批次疫苗樣品，每一列為同一疫苗樣品三個重複。
3.6.2繪製標準曲線：將上表中數據複製到EXCELL表格中，
Value | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
OD750 | 0.102 | 0.149 | 0.336 | 0.504 | 0.836 | 1.122 | 1.334 | 1.702 | 1.923 |
蛋白濃度μg/ml | 0 | 25 | 125 | 250 | 500 | 750 | 1000 | 1500 | 2000 |
採用EXCEL程式，選中1-9列對應的兩行數據→“插入”→“散點圖”，選擇“帶平滑線和數據標記的散點圖”，得到以750nm吸光值為X軸，以蛋白濃度為Y軸的曲線圖。選擇“圖表工具”中“布局”→ “趨勢線”→“其他趨勢線選項”，選中“多項式”、“顯示公式”和“顯示R平方值”。通常R平方值大於等於0.98表明標準曲線可信。每一塊96孔板應設一組標準並繪製相應標準曲線。
3.6.3數值計算
以樣品測定OD750值為X，代入y = 411.69x2+ 220.65x - 3.9423，Y為蛋白濃度，以表中第一批疫苗測定結果為例。該疫苗三重複測定的OD750數據（X）分別為：0.677、0.640、0.641，代入公式計算蛋白含量（Y）分別為：334μg/ml、306μg/ml、307μg/ml，該數據為每毫升水相抗原中總蛋白含量。計算三重複數值的平均值（AVERAGE）為316μg/ml，標準差（STDEV.P）為13.1，變異係數為4.15%（標準差/平均值*100%），將每毫升水相抗原中總蛋白含量，除以2折算為每毫升疫苗總蛋白含量，該疫苗的總蛋白含量為138μg/ml。按照上述方法，可計算其他樣品的總蛋白含量。
3.6.4結果判定
同一樣品不同重複間變異係數應小於5.3%，否則試驗不成立，應重做。若測定值小於或等於500μg/ml，則判定被檢疫苗總蛋白含量符合規定；若測定值大於500μg/ml，則判定被檢疫苗總蛋白含量不符合規定。
