歷史起源
生物的遺傳信息存在於多核昔酸(DNA 或RNA) 分子鏈上, 其鹼基互補可形成雙鏈結構。DNA不能直接表達性狀或指導蛋白質的合成, 它必須通過轉錄mRNA並以此為模板, 合成蛋白質。在轉錄過程中, 雙鏈DNA中作為模板轉錄mRNA的一條鏈稱反義DNA鏈或稱模板鏈。與之互補的另一條非模板鏈, 稱有義DNA鏈。由有義DNA鏈可轉錄反義RNA。這種反義RNA分子在調節基因表達上有重要作用。
在分子生物學上稱為干擾mRNA的互補RNA( micRNA)。現代分子生物學對於怎樣產生或利用反義RNA作了深人的研究和探索, 並已取得可喜的進展。新興發展起來的植物反義基因技術正是利用或人工合成出一段DNA(或cDNA), 再反向裝上啟動子和終止子, 這樣反向克隆的DNA就能象正常的DNA一樣, 轉錄出反義RNA。但這類反義RNA並不能象mRNA那樣, 與核糖體結合, 翻譯出蛋白質, 而是以RNA分子形式存在並與靶基因轉錄的RNA(包括mRNA)分子, 通過鹼基互補, 形成複合體, 從而影響了RNA的剪接、加工以及與核糖體的結合, 阻止了mRNA正常的轉譯和表達, 導致靶基因特異性抑制或產生下向調節效果。理想的反義RNA應該與靶mRNA具特異互補性。兩者在細胞核中同時存在時, 形成反義RNA-mRNA複合體, 阻止了mRNA由核內向細胞質轉移, 造成特定基因失活或關閉, 產生所謂特定單基因突變現象。這在遺傳學研究和植物遺傳改良上很有利用價值。
反義RNA理論與技術的形成和發展是基於原核生物中天然存在的反義R N A 及其調控機理的研究而發展起來的。Tomiazwa於1981年首先報導了反義RNA的分子生物學功能, 他們在研究大腸桿菌質粒複製時, 發現反義R N A 對質粒複製有調節作用。此後在其它原核生物中也相繼發現反義RNA對細菌或噬菌體的基因表達、質粒複製等起調節作用 。
分類
反義基因技術主要包括：反義RNA、反義DNA 及核酶 。
反義RNA
根據反義RNA 的作用機制可將其分為3 類:
I類 反義RNA 直接作用於靶mRNA 的SD 序列和( 或) 部分編碼區, 直接抑制翻譯, 或與靶mRNA 結合形成雙鏈RNA, 從而易被RNA 酶Ⅲ降解;
Ⅱ類 反義RNA 與mRNA 的非編碼區結合, 引起mRNA 構象變化, 抑制翻譯;
Ⅲ類 反義RNA 則直接抑制靶mRNA 的轉錄。
反義DNA
反義DNA 是指一段能與特定的DNA 或RNA以鹼基互補配對的方式結合, 並阻止其轉錄和翻譯的短核酸片段, 主要指反義寡核苷酸, 因更具藥用價值而倍受重視。
核酶
核酶( Ribozyme) 是具有酶活性的RNA, 主要參加RNA 的加工與成熟。天然核酶可分為4 類:
I類異體催化剪下型, 如RnaseP;
Ⅱ類自體催化的剪下型, 如植物類病毒、擬病毒和衛星RNA;
Ⅲ類 第一組內含子自我剪接型, 如四膜蟲人核26S rRNA;
Ⅳ類 第二組內含子自我剪接型。
作用原理
反義RNA 是通過靶RNA 進行鹼基配對結合的方式參與有關的基因表達的調控。目前推測的反義RNA 作用方式有與mRNA 結合形成的二聚體阻斷了核糖核蛋白體同mRNA 的結合, 從而達到了阻斷翻譯的目的; 與mRNA 的結合阻斷了mRNA 向細胞質的運輸; 與mRNA 的結合使得mRNA 易被酶識別而降解。目前尚不清楚是否還有其它的作用方式存在。
常見的獲得反義RNA 的方法與基因工程方法相同。首先, 以mRNA 為模板合成互補配對的一條DNA 鏈, 然後以合成的互補DNA 為模板合成互補配對的另一條DNA 鏈, 此雙鏈DNA 片段就是目的基因片段, 將目的基因片段反向插入適當的載體中, 然後將重組載體導入細胞, 當重組載體基因表達時, 由於是反向插入。因此, 啟動子引導的不是目的基因的轉錄, 而是與目的基因互補配對的反義基因的轉錄, 從而得到反義RNA, 在實際套用中, 構建的反義基因常常只是目的基因的5′端與3′端的部分互補鹼基配對序列, 但長度一般至少要大於50 bp 。
植物中的套用
關於反義基因技術的研究開始也集中在原核生物, 直到真核生物自然反義系統的發現，特別是Izant 等首次證實人工構建的反義寡核昔酸在真核生物中具有生物學效應以來, 反義技術在真核生物中的研究才得以迅速發展。隨其研究而發展形成的反義技術提供了一種更為直接有效的人為控制基因表達的方法而倍受生物學界關注。目前在植物領域的套用尤為凸顯 。
調控果實成熟
利用DNA 重組技術, 人工構建反義基因與反義RNA 系統, 調控生物體內特定基因的表達進而延長植物果實貯藏保鮮, 已成為果蔬貯藏保鮮研究工作中最活躍的領域之一。
改良作物品質
隨著生活水平的提高和科學技術的進步, 人們對稻米等糧食作物食用品質的要求也越來越高。利用反義RNA 技術就可以通過對waxy 基因的遺傳操作降低水稻生物體內特定基因表達水平, 來控制水稻中直鏈澱粉的合成, 從而改變其在胚乳中的相對含量, 達到改良稻米澱粉品質和食用品質的目的, 培育優質水稻新品種。
獲得作物雄性不育系
雄性不育系( 母本) 對提高作物雜交育種效率和效果有非常重要的作用; 是作物雜交育種的技術關鍵, 常規的方法很難得到。目前, 用反義RNA 技術來獲得雄性不育的轉基因植株, 或恢復植株的雄性育性的研究工作在不同植物中取得了積極的成果, 對在雜交種子生產中的套用提供了重要的技術支持。
改變植物花色
植物的花色在園藝和商業上有重要價值, 改變花色一直是園藝學家們孜孜以求的目標。研究表明許多植物花的顏色與類黃酮有關, 苯基苯乙烯酮合成酶( CHS) 是類黃酮生物合成中起關鍵作用的酶;這為利用基因工程調控花色提供了理論依據。
增強植物抗病性
反義技術的建立擴展了機體抵禦外來微生物的經典免疫學概念, 利用反義RNA 技術來阻斷細菌、病毒在細胞中的複製, 20 世紀80 年代末期開始套用於植物抗病的研究。其原理概括就是選擇細菌、病毒複製過程中的關鍵基因作為靶基因, 利用反義技術將其反義基因或片斷轉化進入植物細胞,並使其轉錄的RNA 結合靶基因的mRNA, 使靶基因不能正常表達, 從而達到干擾抑制細菌、病毒複製, 提高植物抗病能力的目的。經過不斷完善, 反義技術在植物抗細菌、病毒的研究中得到了廣泛地利用, 己經取得了積極的效果。
油料作物種子中脂肪酸合成的控制
在改變油料作物油脂的組成方面,近10年來已取得一系列重大突破, 其主要目的是增加飽和脂肪酸的含量或減少飽和脂肪酸的含量。利用反義基因技術將反義丙酮酸羧化酶(PEP基因)導入油菜, Anti-PEP轉化株含油量比對照明顯提高,最高的幾株均增加了15%以上,並且驗證了蛋白質含量與油脂含量呈顯著負相關。
