光合作用第二個階段中的化學反應，沒有光能也可以進行，這個階段叫做暗反應階段（切勿望文生義，並不是指該反應必須在黑暗條件下才能進行）。暗反應階段中的化學反應是在葉綠體內的基質中進行的。
在暗反應階段中，綠葉從外界吸收來的二氧化碳，不能直接被氫[H]還原。它必須首先與植物體內的一種含有五個碳原子的化合物（簡稱五碳化合物，用C5表示）結合，這個過程叫做二氧化碳的固定。一個二氧化碳分子被一個五碳化合物分子固定以後，很快形成兩個含有三個碳原子的化合物（簡稱三碳化合物，用C3表示）。在有關酶的催化作用下，三碳化合物接受ATP釋放出的能量並且被氫[H]還原。其中，一些三碳化合物經過一系列變化，形成糖類；另一些三碳化合物則經過複雜的變化，又形成五碳化合物，從而使暗反應階段的化學反應循環往復地進行下去。
