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範圍
本標準 規定了原料乳、乳製品以及含乳製品中三聚氰胺的三種測定方法，即高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-質譜/質譜法（LC-MS/MS）和氣相色譜-質譜聯用法[包括氣相色譜-質譜法（GC-MS），氣相色譜-質譜/質譜法（GC-MS/MS）]。
本標準適用於原料乳、乳製品以及含乳製品中三聚氰胺的定量測定；液相色譜-質譜/質譜法、氣相色譜-質譜（包括氣相色譜-質譜/質譜）法同時適用於原料乳、乳製品以及含乳製品中三聚氰胺的定性確證。
本標準高效液相色譜法的定量限為2 mg/kg，液相色譜-質譜/質譜法的定量限為0.01 mg/kg，氣相色譜-質譜法的定量限為0.05 mg/kg（其中氣相色譜-質譜/質譜法的定量限為0.005 mg/kg）。
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GB/T 6682 分析實驗室用水規格和試驗方法
第一法高效液相色譜法
原理
試樣用三氯乙酸溶液-乙腈提取，經陽離子交換固相萃取柱淨化後，用高效液相色譜測定，外標法定量。
試劑與材料
除非另有說明，所有試劑均為分析純，水為GB/T 6682規定的一級水。
（1）甲醇：色譜純。
（2）乙腈：色譜純。
（3）氨水：含量為25%～28%。
（4）三氯乙酸。
（5）檸檬酸。
（6）辛烷磺酸鈉：色譜純。
（7）甲醇水溶液：準確量取50 mL 甲醇和50 mL 水，混勻後備用。
（8） 三氯乙酸溶液（1%）：準確稱取10 g 三氯乙酸於1 L 容量瓶中，用水溶解並定容至刻度，混勻後備用。
（9） 氨化甲醇溶液（5%）：準確量取5 mL 氨水和95 mL 甲醇，混勻後備用。
（10）離子對試劑緩衝液：準確稱取2.10 g 檸檬酸和2.16 g 辛烷磺酸鈉，加入約980 mL 水溶解，調節pH 至3.0 後，定容至1L 備用。
（11）三聚氰胺標準品：CAS 108-78-01，純度大於99.0%。
（12） 三聚氰胺標準儲備液：準確稱取100 mg（精確到0.1 mg）三聚氰胺標準品於100 mL 容量瓶中，用甲醇水溶液（7）溶解並定容至刻度，配製成濃度為1 mg/mL 的標準儲備液，於4℃避光保存。
（13） 陽離子交換固相萃取柱：混合型陽離子交換固相萃取柱，基質為苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60 mg，3 mL，或相當者。使用前依次用3 mL 甲醇、5 mL 水活化。
（14）定性濾紙。
（15）海砂：化學純，粒度0.65 mm～0.85 mm，二氧化矽（SiO）含量為99%。
（16）微孔濾膜：0.2 μm，有機相。
（17）氮氣：純度大於等於99.999%。
儀器和設備
（1）高效液相色譜（HPLC）儀：配有紫外檢測器或二極體陣列檢測器。
（2）分析天平：感量為0.0001 g和0.01 g。
（3）離心機：轉速不低於4000 r/min。
（4）超音波水浴。
（5）固相萃取裝置。
（6）氮氣吹乾儀。
（7）渦旋混合器。
（8）具塞塑膠離心管：50 mL。
（9）研缽。
樣品處理
（1）提取
a）液態奶、奶粉、優酪乳、冰淇淋和奶糖等
稱取2 g（精確至0.01 g）試樣於50 mL具塞塑膠離心管中，加入15 mL三氯乙酸溶液和5 mL乙腈，超聲提取10 min，再振盪提取10 min後，以不低於4000 r/min離心10 min。上清液經三氯乙酸溶液潤濕的濾紙過濾後，用三氯乙酸溶液定容至25 mL，移取5 mL濾液，加入5 mL水混勻後做待淨化液。
b）乳酪、奶油和朱古力等
稱取2 g（精確至0.01 g）試樣於研缽中，加入適量海砂（試樣質量的4倍～6倍）研磨成乾粉狀，轉移至50 mL具塞塑膠離心管中，用15 mL三氯乙酸溶液分數次清洗研缽，清洗液轉入離心管中，再往離心管中加入5 mL乙腈，餘下操作同上中“超聲提取10 min，……加入5 mL水混勻後做待淨化液”。
註：若樣品中脂肪含量較高，可以用三氯乙酸溶液飽和的正己烷液-液分配除脂後再用SPE柱淨化。
（2）淨化
將待淨化液轉移至固相萃取柱中。依次用3 mL水和3 mL甲醇洗滌，抽至近乾後，用6 mL氨化甲醇溶液洗脫。整個固相萃取過程流速不超過1 mL/min。洗脫液於50℃下用氮氣吹乾，殘留物（相當於0.4 g樣品）用1 mL流動相定容，渦旋混合1 min，過微孔濾膜後，供HPLC測定。
高效液相色譜測定
（1）HPLC 參考條件
a) 色譜柱：C8柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相當者；C18柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相當者。
b) 流動相：C8柱，離子對試劑緩衝液（3.2.10）-乙腈（85+15，體積比），混勻。
C18柱，離子對試劑緩衝液（3.2.10）-乙腈（90+10，體積比），混勻。
c) 流速：1.0 mL/min。
d) 柱溫：40℃。
e) 波長：240 nm。
f) 進樣量：20 μL。
（2）標準曲線的繪製
用流動相將三聚氰胺標準儲備液逐級稀釋得到的濃度為0.8、2、20、40、80 μg/mL 的標準工作液，濃度由低到高進樣檢測，以峰面積-濃度作圖，得到標準曲線回歸方程。基質匹配加標三聚氰胺的樣品HPLC 色譜圖參見附錄A 中的圖A.1。
（3）定量測定
待測樣液中三聚氰胺的回響值應在標準曲線線性範圍內，超過線性範圍則應稀釋後再進樣分析。
（4）結果計算
試樣中三聚氰胺的含量由色譜數據處理軟體或按式（1）計算獲得：
A × c × V×1000
X= × f ……………………（1）
As × m×1000
式中：
X —— 試樣中三聚氰胺的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；
A —— 樣液中三聚氰胺的峰面積；
c —— 標準溶液中三聚氰胺的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；
V —— 樣液最終定容體積，單位為毫升（mL）；
As —— 標準溶液中三聚氰胺的峰面積；
m —— 試樣的質量，單位為克（g）；
f —— 稀釋倍數。
空白實驗
除不稱取樣品外，均按上述測定條件和步驟進行。
方法定量限
本方法的定量限為2 mg/kg。
回收率
在添加濃度2 mg/kg～10 mg/kg濃度範圍內，回收率在80%～110%之間，相對標準偏差小於10%。
允許差
在重複性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。
第二法液相色譜-質譜/質譜法
原理
試樣用三氯乙酸溶液提取，經陽離子交換固相萃取柱淨化後，用液相色譜-質譜/質譜法測定和確證，外標法定量。
試劑與材料
除非另有說明，所有試劑均為分析純，水為GB/T 6682規定的一級水。
（1）乙酸。
（2） 乙酸銨。
（3）乙酸銨溶液（10 mmol/L）：準確稱取0.772 g 乙酸銨於1 L 容量瓶中，用水溶解並定容至刻度，混勻後備用。
（4）其他同第一法。
儀器和設備
（1）液相色譜-質譜/質譜（LC-MS/MS）儀：配有電噴霧離子源（ESI）。
（2）其他同第一法。
樣品處理
（1）提取
a）液態奶、奶粉、優酪乳、冰淇淋和奶糖等
稱取1 g（精確至0.01 g）試樣於50 mL具塞塑膠離心管中，加入8 mL三氯乙酸溶液和2 mL乙腈，超聲提取10 min，再振盪提取10 min後，以不低於4000 r/min離心10 min。上清液經三氯乙酸溶液潤濕的濾紙過濾後，做待淨化液。
b）乳酪、奶油和朱古力等
稱取1 g（精確至0.01 g）試樣於研缽中，加入適量海砂（試樣質量的4倍～6倍）研磨成乾粉狀，轉移至50 mL具塞塑膠離心管中，加入8 mL三氯乙酸溶液分數次清洗研缽，清洗液轉入離心管中，再加入2mL乙腈，餘下操作同上中“超聲提取10 min，……做待淨化液”。
註：若樣品中脂肪含量較高，可以用三氯乙酸溶液飽和的正己烷液-液分配除脂後再用SPE柱淨化。
（2）淨化
將待淨化液轉移至固相萃取柱中。依次用3 mL水和3 mL甲醇洗滌，抽至近乾後，用6 mL氨化甲醇溶液洗脫。整個固相萃取過程流速不超過1 mL/min。洗脫液於50℃下用氮氣吹乾，殘留物（相當於1 g試樣）用1 mL流動相定容，渦旋混合1 min，過微孔濾膜後，供LC-MS/MS測定。
液相色譜-質譜/質譜測定
（1）LC 參考條件
a) 色譜柱：強陽離子交換與反相C18混合填料，混合比例（1：4），150 mm×2.0 mm（i.d.），5 μm，或相當者。
b) 流動相：等體積的乙酸銨溶液和乙腈充分混合，用乙酸調節至pH=3.0後備用。
c) 進樣量：10 μL。
d) 柱溫：40℃。
e) 流速：0.2 mL/min。
（2）MS/MS 參考條件
a) 電離方式：電噴霧電離，正離子。
b) 離子噴霧電壓：4 kV。
c) 霧化氣：氮氣，40 psi。
d) 乾燥氣：氮氣，流速10 L/min，溫度350℃。
e) 碰撞氣：氮氣。
f) 解析度：Q1（單位）Q3（單位）。
g) 掃描模式：多反應監測（MRM），母離子m/z 127，定量子離子m/z 85，定性子離子m/z 68。
h) 停留時間：0.3 s。
i) 裂解電壓：100 V。
j) 碰撞能量：m/z 127>85 為20 V，m/z 127>68 為35 V。
（3）標準曲線的繪製
取空白樣品同上 處理。用所得的樣品溶液將三聚氰胺標準儲備液逐級稀釋得到的濃度為0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 μg/mL 的標準工作液，濃度由低到高進樣檢測，以定量子離子峰面積-濃度作圖，得到標準曲線回歸方程。基質匹配加標三聚氰胺的樣品LC-MS/MS 多反應監測質量色譜圖參見附錄A 中的圖A.2。
（4） 定量測定
待測樣液中三聚氰胺的回響值應在標準曲線線性範圍內，超過線性範圍則應稀釋後再進樣分析。
（5）定性判定
按照上述條件測定試樣和標準工作溶液，如果試樣中的質量色譜峰保留時間與標準工作溶液一致（變化範圍在±2.5%之內）；樣品中目標化合物的兩個子離子的相對豐度與濃度相當標準溶液的相對豐度一致，相對豐度偏差不超過表1的規定，則可判斷樣品中存在三聚氰胺。
表1 定性離子相對豐度的最大允許偏差
6）結果計算
同第一法。
空白實驗
除不稱取樣品外，均按上述測定條件和步驟進行。
方法定量限
本方法的定量限為0.01 mg/kg。
回收率
在添加濃度0.01 mg/kg～0.5 mg/kg濃度範圍內，回收率在80%～110%之間，相對標準偏差小於10%。
允許差
在重複性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的15%。
第三法氣相色譜-質譜聯用法
原理
試樣經超聲提取、固相萃取淨化後，進行矽烷化衍生，衍生產物採用選擇離子監測質譜掃描模式（SIM）或多反應監測質譜掃描模式（MRM），用化合物的保留時間和質譜碎片的豐度比定性，外標法定量。
相對離子豐度>50% >20%至50% >10%至20% ≤10%
允許的相對偏差±20% ±25% ±30% ±50%
試劑與材料
除非另有說明，所有試劑均為分析純，水為GB/T 6682規定的一級水。
（1）吡啶：優級純。
（2）乙酸鉛。
（3）衍生化試劑：N,O-雙三甲基矽基三氟乙醯胺（BSTFA）+三甲基氯矽烷（TMCS）（99+1），色譜純。
（4）乙酸鉛溶液（22 g/L）：取22 g 乙酸鉛用約300 mL 水溶解後定容至1 L。
（5）三聚氰胺標準溶液：準確吸取三聚氰胺標準儲備液1 mL 於100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，此標準溶液1 mL 相當於10 μg 三聚氰胺標準品，於4℃冰櫃內儲存，有效期3 個月。
（6） 氬氣：純度大於等於99.999%。
（7）氦氣：純度大於等於99.999%。
（8）其他同第一法。
儀器和設備
（1）氣相色譜-質譜（GC-MS）儀：配有電子轟擊電離離子源（EI）。
（2）氣相色譜-質譜/質譜（GC-MS/MS）儀：配有電子轟擊電離離子源（EI）。
（3）電子恆溫箱。
（4）其他同第一法。
樣品處理
（1）GC-MS法
a）提取
液態奶、奶粉、優酪乳和奶糖等
稱取5 g（精確至0.01 g）樣品於50 mL具塞比色管，加入25 mL三氯乙酸溶液，渦漩振盪30 s，再加入15 mL三氯乙酸溶液，超聲提取15 min，加入2 mL乙酸鉛溶液，用三氯乙酸溶液定容至刻度。充分混勻後，轉移上層提取液約30 mL至50 mL離心試管，以不低於4000 r/min離心10 min。上清液待淨化。
乳酪、奶油和朱古力等
稱取5 g（精確至0.01g）樣品於50 mL具塞比色管中，用5 mL熱水溶解（必要時可適當加熱），再加入20 mL三氯乙酸溶液，渦漩振盪30 s，再加入15 mL三氯乙酸溶液超聲提取及以下操作同上。若樣品中脂肪含量較高，可以先用乙醚脫脂後再用三氯乙酸溶液提取。
b）淨化
準確移取5 mL的待淨化濾液至固相萃取柱中。再用3 mL水、3 mL甲醇淋洗，棄淋洗液，抽近乾後用3 mL氨化甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，50℃下氮氣吹乾。
（2）GC-MS/MS法
a）提取
奶粉、乳酪、奶油、朱古力和奶糖等
稱取0.5 g（精確至0.01 g）試樣，加入5 mL甲醇水溶液），渦旋混勻2 min後，超聲提取15 min ~20min，以不低於4000 r/min離心10 min，取上清液200 μL用微孔濾膜過濾，50℃下氮氣吹乾。
液態奶和優酪乳等
稱取1 g（精確至0.01 g）試樣，加入5 mL甲醇，渦旋混勻2 min後，超聲提取及以下操作同上。
b）衍生化
取上述氮氣吹乾殘留物，加入600 μL的吡啶和200 μL衍生化試劑，混勻，70℃反應30 min後，供GC-MS或GC-MS/MS法定量檢測或確證。
氣相色譜-質譜測定
（1）儀器參考條件
GC-MS參考條件
a) 色譜柱：5%苯基二甲基聚矽氧烷石英毛細管柱，30 m×0.25 mm（i.d.）×0.25 μm，或相當者。
b) 流速：1.0 mL/min。
c) 程式升溫：70℃保持1 min，以10℃/min 的速率升溫至200℃，保持10 min。
d) 傳輸線溫度：280℃。
e) 進樣口溫度：250℃。
f) 進樣方式：不分流進樣。
g) 進樣量：1 μL。
h) 電離方式：電子轟擊電離（EI）。
i) 電離能量：70 eV。
j) 離子源溫度：230℃。
k) 掃描模式：選擇離子掃描，定性離子m/z 99、171、327、342，定量離子m/z 327。
GC-MS/MS 參考條件
a) 色譜柱：5%苯基二甲基聚矽氧烷石英毛細管柱，30 m×0.25 mm（i.d.）×0.25 μm，或相當者。
b) 流速：1.3 mL/min。
c) 程式升溫：75℃保持1 min，以30℃/min 的速率升溫至220℃，再以5℃/min 的速率升溫至250℃，
保持2 min。
d) 進樣口溫度：250℃。
e) 接口溫度：250℃。
f) 進樣方式：不分流進樣。
g) 進樣量：1 μL。
h) 電離方式：電子轟擊電離（EI）。
i) 電離能量：70 eV。
j) 離子源溫度：220℃。
k) 四級桿溫度：150℃。
l) 碰撞氣：氬氣，1.8 mTorr。
m) 碰撞能量：15 V。
n) 掃描方式：多反應監測（MRM），定量離子m/z 342>327，定性離子m/z 342>327，342>171。
（2） 標準曲線的繪製
GC-MS法
準確吸取三聚氰胺標準溶液0、0.4、0.8、1.6、4、8、16 mL 於7 個100 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。各取1 mL 用氮氣吹乾，按照上法 步驟衍生化。配製成衍生產物濃度分別為0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 μg/mL 的標準溶液。反應液供GC-MS 測定。以標準工作溶液濃度為橫坐標，定量離子質量色譜峰面積為縱坐標，繪製標準工作曲線。標準溶液的GC-MS 選擇離子質量色譜圖參見附錄A 中的圖A.3，三聚氰胺衍生物選擇離子質譜圖參見附錄A 中的圖A.4。
GC-MS/MS法
準確吸取三聚氰胺標準溶液0、0.04、0.08、0.4、0.8、4、8 mL分別於7個100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。各取1 mL用氮氣吹乾，按照上法步驟衍生化。配製成衍生化產物濃度分別為0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1 μg/mL的標準溶液。反應液供GC-MS/MS測定。以標準工作溶液濃度為橫坐標，定量離子質量色譜峰面積為縱坐標，繪製標準工作曲線。標準溶液的GC-MS/MS多反應監測質量色譜圖參見附錄A中的圖A.5。
（3）定量測定
待測樣液中三聚氰胺的回響值應在標準曲線線性範圍內，超過線性範圍則應對淨化液稀釋，重新衍
生化後再進樣分析。
（4）定性判定
GC-MS 法
以標準樣品的保留時間和監測離子（m/z 99、171、327 和342）定性，待測樣品中4 個離子（m/z99、171、327 和342）的豐度比與標準品的相同離子豐度比相差不大於20%。
GC-MS/MS 法以標準樣品的保留時間以及多反應監測離子（m/z 342>327、342>171）定性，其他定性判定原則同第一法。
（5）結果計算
同第一法。
空白實驗
除不稱取樣品外，均按上述測定條件和步驟進行。
方法定量限
本方法中，氣相色譜-質譜法（GC-MS法）的定量限為0.05 mg/kg，氣相色譜-質譜/質譜法（GC-MS/MS法）的定量限為0.005 mg/kg。
回收率
GC-MS法：在添加濃度0.05 mg/kg～2 mg/kg濃度範圍內，回收率在70%～110%之間，相對標準偏差小於10%。
GC-MS/MS法：在添加濃度0.005 mg/kg～1 mg/kg濃度範圍內，回收率在90%～105%之間，相對標準偏差小於10%。
允許差
在重複性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的15%。
附錄A
(資料性附錄)
三聚氰胺標準品色譜圖
圖A.1 基質匹配加標三聚氰胺的樣品HPLC 色譜圖
（檢測波長240 nm，保留時間13.6 min，C8 色譜柱
圖A.2 基質匹配加標三聚氰胺的樣品LC-MS/MS 多反應監測質量色譜圖
（保留時間4.2 min，定性離子m/z 127>85 和m/z 127>68
圖A.3 三聚氰胺衍生物GC-MS 選擇離子色譜圖
（保留時間12.514 min）
圖A.4 三聚氰胺衍生物GC-MS 選擇離子質譜圖
（定性離子：m/z 99、171、327 和342）
圖A.5 三聚氰胺衍生物GC-MS/MS 多反應監測質量色譜圖
（保留時間7.25 min，定性離子m/z 342>171 和m/z 342>327
