原理
蛋白質是親水膠體,借水化膜和同性電荷(在PH值7.0的溶液中一般蛋白質帶負電荷〉維持膠體的穩定性。向蚩白質溶液中加入某種鹼金屬或鹼土金厲的中性鹽類,則發生電荷中和現象(失去電荷)。當鹽類的濃度足夠大時,蛋白質膠粒脫水而沉澱,稱為鹽析。由鹽析所得的頊沉澱,經過透析或用水稀釋以減低或除去鹽後,能再溶解並恢2其分子原有結構及生物活性,因此由鹽析生成的沉澱是可逆性沉澱。各種蛋白質分子顆粒大小、親水 度不同,故鹽析所需耍的鹽濃度也不一樣。調節混合蛋白質溶液中鹽的濃度.可使各種 質分段沉澱。球蛋白在個飽和硫酸銨溶液中即可析出,白蛋白則需在飽和硫酸鈸溶液中才能沉澱,此法是蚩白質分離純化過程中的常用方法。
蛋白質的分子很大,其顆粒在膠體顆粒範圍(直徑1~100nm)內,所以不能透過半透膜。選 孔徑合宜的卞透股,由於小分子物質能夠透過,而蚩白質顆粒不能透過,因此可使蛋白質和小分於物質分開。這種方法可除去和 白質混合的中性鹽及其他小分子物質。這種技術叫做透析,是常川來純化蛋白質的方法。由鹽析所得的蛋白質沉澱,經過透析脫鹽後仍可恢復其故有結構及生物活性。
操作步驟
1. 分段鹽析的條件先需要進行小實驗探索,如:先進行0%-30%的硫酸銨沉澱,再進行30%-60%的硫酸銨沉澱,最後進行60%-80%的硫酸銨沉澱。
2. 每一段鹽析靜置之後都將離心取沉澱,透析並檢測活性。通過實驗結果可以看出哪一段鹽析出來的目的產物最多,相對來說雜質就更少。
3. 比如實驗中的活性物質主要在60%-80%這段出來,在以後的實驗中,就可以首先進行0%-60%的硫酸銨沉澱,這段沉澱物可以拋棄(去處大多數雜質);然後進行60%-80%的硫酸銨沉澱,這段沉澱出來是物質是所需要的目的物質含量比較高的物質,將其收集進行下一步純化工作 。